Bitkilerde 2,4-Dibromofenol Metabolizmasının Aydınlatılması

Antropojenik faaliyetler ^1,2 nedeniyle artan sayıda organik kirletici çevreye atılmıştır^ve toprak bu kirleticiler için önemli bir yutak olarak kabul edilmektedir ^3,4. Topraktaki kirleticiler bitkiler tarafından alınabilir ve mahsul tüketimi yoluyla doğrudan insan vücuduna girerek gıda zincirleri boyunca potansiyel olarak daha yüksek trofik seviyeli organizmalara aktarılabilir ve sonuç olarak istenmeyen maruziyete yol açabilir ^5,6. Bitkiler, detoksifikasyon için ksenobiyotikleri metabolize etmek için farklı yollar kullanır⁷; Ksenobiyotiklerin metabolizmasını aydınlatmak, bitkilerdeki kirleticilerin gerçek kaderini kontrol ettiği için önemlidir. Metabolitler yapraklar (atmosfere) veya kökler tarafından atılabildiğinden, maruziyetin çok erken aşamalarında metabolitlerin belirlenmesi, bu nedenle çok sayıda metaboliti test etme imkanı sağlar⁸. Bununla birlikte, bozulmamış bitkiler kullanılarak yapılan çalışmalar, çeşitli faktörlerden etkilenebilecek uzun süreli deneyler ve karmaşık numune hazırlama protokolleri gerektirir.

Bu nedenle bitki kallus kültürleri, tedavi süresini büyük ölçüde kısaltabildikleri için plantadaki ksenobiyotiklerin metabolizmasını incelemek için iyi bir alternatiftir. Bu kültürler mikrobiyal girişimi ve fotokimyasal bozunmayı dışlar, bozulmamış bitkilerin matris etkisini basitleştirir, yetiştirme koşullarını standartlaştırır ve daha az deneysel çaba gerektirir. Bitki kallus kültürleri, triklosan⁹, nonilfenol¹⁰ ve tebukonazol^8'in metabolik çalışmalarında alternatif bir yaklaşım olarak başarıyla uygulanmıştır. Bu çalışmalar, kallus kültürlerindeki metabolik modellerin bozulmamış bitkilerdekilere benzer olduğunu göstermiştir. Bu çalışma, karmaşık ve zaman alıcı protokoller olmadan bitkilerde ksenobiyotiklerin metabolitlerinin verimli ve doğru bir şekilde tanımlanması için bir yöntem önermektedir. Burada, düşük yoğunluklu sinyallere sahip metabolitlerin analizi için yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi ile birlikte bitki kallus kültürlerini^{kullanıyoruz 11,12}.

Bu amaçla, havuç (Daucus carota var. sativus) kallus süspansiyonları, 130 rpm ve 26 °C'de bir çalkalayıcıda 120 saat boyunca 100 μg/L 2,4-dibromofenole maruz bırakıldı. 2,4-dibromofenol, yıkıcı endokrin aktivitesi¹³ ve toprakta yaygın olarak görülmesi^{nedeniyle seçilmiştir 14}. Metabolitler ekstrakte edildi ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi ile analiz edildi. Burada önerilen protokol, iyonize olabilen diğer organik bileşik türlerinin bitki metabolizmasını araştırabilir.

1. Havuç nasırının farklılaşması

NOT: Burada kullanılan tüm ekipmanları otoklavlayın ve tüm işlemleri UV ile sterilize edilmiş ultra temiz bir tezgahta gerçekleştirin.

1. Tek tip havuç tohumlarını (Daucus carota var. sativus) 4 °C'de 16 saat boyunca deiyonize suya batırarak tohumları vernalize edin.
2. Vernalize tohumları 20 dakika boyunca %75 etanol ile yüzey sterilize edin ve ardından aseptik koşullar altında steril deiyonize su ile üç kez durulayın.
3. Tohumları 20 dakika boyunca% 20_H2O2ile sterilize edin ve aseptik koşullar altında altı kez sterilize deiyonize su ile yıkayın.
4. Tohumları% 1 agar-jel içeren hormonsuz MS ortamına (pH 5.8, 121 ° C'de 20 dakika otoklavlanmış) ekerek ve 26 ° C'de 16 saatlik bir fotoperiyot (350 μmol / m²s) ile 15 gün boyunca inkübe ederek aseptik olarak çimlendirin.
5. Fidelerin hipokotil ve kotiledonunu küçük parçalara (0,5 cm) keserek eksplantları elde edin.
6. Eksplantları, aseptik koşullar altında oksimon (2,4-diklorofenoksiasetik asit; 1 mg/L) ve fitokinin (6-benzilaminopurin; 0.5 mg/L) ile takviye edilmiş 15-20 mL aseptik MS ortamı içeren Petri kaplarına (tabak başına iki ila dört eksplant) dönüştürün.
7. Nasırı indüklemek için eksplantları karanlıkta 26 °C'de 3-4 hafta inkübe edin.
8. Steril bir neşter ve forseps kullanarak ilk eksplantlardan oluşan kallus dokularını (yaklaşık 1 cm çapında) ayırın.
   NOT: Yeni oluşan kallus dokuları beyaz ila kremsi sarı renktedir ve ilk eksplantlara gevşek bir şekilde bağlanır.

2. 2,4-dibromofenol tedavisi

1. 1 μg 2,4-dibromofenolü 10 mL aseptik sıvı MS ortamında çözün (2,4-dibromofenolün nihai konsantrasyonu 100 ppb, pH 5.6-7.0'dır).
2. Aseptik koşullar altında hazırlanan 2,4-dibromofenol çözeltisini (adım 2.1'den itibaren) içeren cam şişelere 3 g taze havuç kallus (adım 1.8) ekleyin. Bunu 2,4-dibromofenol tedavisi olarak düşünün.
   NOT: Cam şişeler otoklavlandı ve parafin film kullanılarak kapatıldı.
3. 2,4-dibromofenolün abiyotik bozunmasını değerlendirmek için yalnızca 2,4-dibromofenol çözeltisini (adım 2.1'de hazırlanan) içeren bir ortam kontrolü ekleyin.
4. Herhangi bir potansiyel kontaminasyonu kontrol etmek için yalnızca havuç nasırını (2,4-dibromofenol çözeltisi yok) içeren boş bir kontrol ekleyin.
   1. 10 mL steril MS ortamına sadece 3 g taze toplanmış havuç nasır ekleyerek havuç içeren boş kontrolü hazırlayın.
5. 2,4-dibromofenol tedavisini ve ortam ve boş kontrolleri 130 rpm ve 26 ° C'de karanlıkta 120 saat boyunca bir inkübatörde inkübe edin.
6. 120 saatlik inkübasyondan sonra 2,4-dibromofenol tedavisinden ve kontrollerden numuneleri toplamak için cam şişeleri inkübatörden çıkarın.
   NOT: Tüm örnekler üç nüsha halinde hazırlanmıştır.

3. Numune hazırlama

1. 2,4-dibromofenol tedavisi ve kontroller için cam elyaf filtrelerle (0.45 μm) filtrasyon yaparak nasırı MS ortamından dikkatlice ayırın. Üç kez ultra saf suyla yıkadıktan sonra nasırı toplayın.
2. Toplanan kallusu sıvı nitrojen ile dondurarak kurutun ve ardından toplanan kallusu (0,2 g) yüksek verimli bir doku öğütücü ile 70 Hz'de 3 dakika boyunca homojenize edin.
3. Bir cam mikroşırınga ile 50 μL 25 mg / L vekil 4-n-NP-d₄ ekleyerek ve ardından 1 dakika vorteksleyerek homojenize kallusu artırın.
4. 2,4-dibromofenol ve metabolitleri çıkarmak için 30 dakika boyunca buzlu su ile doldurulmuş bir ultrasonicator (150 W, 40 kHz) içinde 5 mL metanol / su (1: 1, v / v) ile örnekleri sonikleştirin.
5. Süspansiyonları 8.000 x g'de 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanları pipetleyerek toplayın.
   1. Kallus örneği için ekstraksiyon işlemlerini üç kez tekrarlayın ve ekstraktları birleştirin.
6. Ekstraktları 1 mL/dk akış hızına sahip hidrofilik lipofilik dengeli katı faz ekstraksiyonu (HLB SPE) kartuşlarından geçirin.
   NOT: HLB SPE kartuşları, herhangi bir paraziti gidermek için 6 mL metanol ve 6 mL su ile sırayla ön işleme tabi tutulmuştur.
7. HLB SPE kartuşlarından 6 mL metanol geçirerek analitleri elute edin. Daha sonra, enstrümantal analiz için elde edilen eluentleri hafif bir nitrojen gazı akışı altında 1 mL'ye konsantre edin.
8. 2,4-dibromofenol ve metabolitlerinin analizi için UPLC-Q-TOF-MS'ye 10 μL ortaya çıkan eluentleri enjekte edin¹⁵.
   1. Enstrümantal analizden önce tüm numuneleri 0,22 μm naylon membran ile filtreleyin.

4. Enstrümantal analiz

NOT: 2,4-dibromofenol ve metabolitlerinin analizleri, pozitif ve negatif iyon modunda çalışan bir elektrosprey iyonizasyonu (ESI) ile donatılmış bir mikro-OTOF-QII kütle spektrometresi ile kombinasyon halinde ultra performanslı bir sıvı kromatografı (UPLC) üzerinde gerçekleştirilmiştir.

1. Kolon ısıtıcı kapısını açın ve kolon girişini enjeksiyon valfine ve kolon çıkışını kütle spektrometresinin girişine bağlayarak UPLC kolonunu takın.
   NOT: 40 °C'de analitlerin ayrılması için bir C18 kolonu (50 mm x 2,1 mm; 1,7 μm partikül boyutu) kullanılmıştır.
2. Mobil faz A'yı (ultra saf su) ve mobil faz B'yi (kromatografi dereceli metanol), sırasıyla çözücü tüpleri A ve B'nin ucunu ilgili çözücü şişelerine sokarak cihaza bağlayın.
   1. Tüm mobil fazları (her biri için 500 mL) 0.22 μm'lik bir filtreden geçirin ve 30 dakikadan fazla sonikasyon yapın.
3. Yazılım penceresinde, Enstrüman | Sıvı kromatogramının koşullarını düzenlemek için Giriş Yöntemi.
   1. Mobil faz B'nin gradyan koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın: 1.0 mL/dak'lık bir akış hızı; 0-0.5 dk,% 5; 0.5-3.5 dakika,% 5 ila% 50; 3.5-6.5 dk,% 50 ila% 100; 6.5-7 dakika, %100; 7-10 dakika, %100 ila %5.
   2. Numunelerin UPLC-Q-TOF-MS'ye enjeksiyon hızını 0,2 mL/dk olarak ayarlayın.
      NOT: Numunenin enjeksiyonu, tam otomatik bir örnekleyici kullanılarak programlanır.
4. Yazılım penceresinde MS Metodu'nu seçin ve ardından Q-TOF-MS parametrelerini ayarlayın: 8 L/dak'lık bir kurutma gazı (_N2) akış hızı, 300-350 °C'lik bir sıcaklık; 4.500 V'luk bir kılcal voltaj; 5-45 V'luk bir çarpışma enerjisi; ve 40-800 Da tam tarama aralığı.
5. Numune şişelerini seri numarasına göre numune tepsilerinin ilgili yerlerine yerleştirin ve numune tepsilerini numune odasına yeniden yerleştirin.
   NOT: Numune tepsilerini düz tutun ve numune odasının kapısının kapalı olduğundan emin olun.
6. Yazılım penceresinde Dosya | Veritabanı oluşturmak için yeni. Veritabanını adlandırın.
7. MS Dosyası | Giriş dosyası | Hacim enjekte edin.
8. Dosya | Kaydet'i tıklayın.
9. Çalıştır'ı seçin | Yazılım ana penceresinde başlatın ve ardından Örnek Verileri Al'ı seçin ve veri toplamak için örnek listeyi başlat çalıştırma penceresinde Tamam'a tıklayın.
   NOT: Gerçek zamanlı kromatogram, Kromatogram | Veri toplama işlemi sırasında Gerçek Zamanlı Güncelleme.
10. Hedef veri satırını seçerek ve MS tarama kromatogramını görüntülemek için Kromatogram penceresine tıklayarak yazılımdaki verileri işleyin.
11. Kromatogram penceresinde Görüntüle | TİC | ScanWaveDS | İzleme ekle | Kızının kütle spektrumlarını taramasını sağlamak için tamam.
12. 2,4-dibromofenol tedavisinin kromatogramlarını ve kontrolleri karşılaştırarak metabolitleri tanımlayın.
13. Metabolit adaylarını alıkonma süresi, kütle ve parçalanma paternlerine göre açıklayın^16,17.
    NOT: Metabolit adaylarının ana iyonlarının deneysel m/z değerleri ile karşılık gelen teorik m/z değerleri arasındaki kütle doğruluğu hatası 10 ppm'den az olmalıdır.

Protokolün adımları Şekil 1'de gösterilmiştir. Protokolü takiben, 2,4-dibromofenol tedavisinden elde edilen havuç kallus ekstraktının kromatogramını kontrollerle karşılaştırdık ve 2,4-dibromofenol tedavisinde bulunan ancak kontrollerde bulunmayan sekiz farklı pik bulduk (Şekil 2). Bu, 2,4-dibromofenol ile muamele edilmiş havuç kallusunda toplam sekiz 2,4-dibromofenol metabolitinin (M562, M545, M661, M413, M339, M380, M424 ve M187) başarıyla tespit edildiğini gösterir. Ek olarak, 2,4-dibromofenol tedavisinin kromatogramında ana 2,4-dibromofenolün zirvesi (alıkonma süresi = 0.85 dakika) bulunmadı (Şekil 2), bu da 2,4-dibromofenolün havuç kallusunda hızla metabolize edildiğini gösteriyor.

Havuç kallusundaki 2,4-dibromofenol metabolitlerini tanımlamak için kullanılan kromatografik ve kütle bilgisi Tablo 1'de özetlenmiştir. Havuç kallusunda inkübe edilen 2,4-dibromofenol, glikoz (M562, M545, M661 ve M413) ve amino asitler (M339, M380 ve M424) ile doğrudan konjugasyon yoluyla metabolitlerin oluşumuna yol açtı. Örneğin, M413, dibutil ftalat (DBP) ve glikoza (C6H11O5) karşılık gelen m/z 250.8954 ve 163.1485'teparçalar üretti. M413 ayrıca pentoz veya heksoz eklenerek disakkarit konjugasyon metabolitleri M661, M545 ve M562 oluşturmak üzere metabolize edildi. M339, M380 ve M424'ün 2,4-dibromofenol alanin, 2,4-dibromofenol asetilalanin ve 2,4-dibromofenol asetillaspartik asit olduğu tahmin edildi, çünkü karakteristik nötr amino asit kaybına sahipler (C3H6NO2), asetilalanin (C5H88NO3) ve asetillaspartik asit (C6H8NO5), m/z 89.0932'de karşılık gelen fragmanları üreten, Sırasıyla 129.1140 ve 173.1235,15. Sunulan sonuçlar, bitki kallus kültürlerinin mahsullerdeki ksenobiyotiklerin metabolizmasını aydınlatmak için etkili ve güvenilir bir araç olarak kullanılabileceğini göstermektedir.

Şekil 1: Yöntem şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: 2,4-dibromofenol için kromatogramlar (eklenen resim) ve 2,4-dibromofenolün metabolitleri. Bu rakam Sun ve ark.15'in izniyle uyarlanmıştır. Telif Hakkı (2018) Amerikan Kimya Derneği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Havuç kallus ekstraktlarında keşfedilen 2,4-dibromofenol ve metabolitlerinin özeti. Bu tablo Sun ve ark.15'in izniyle uyarlanmıştır. Telif Hakkı (2018) Amerikan Kimya Derneği.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.