Burada, manyetik rezonans kılavuzluğunda odaklanmış ultrason kullanılarak bir in vivo fare glioblastoma modelinde sonodinamik tedavinin nasıl gerçekleştirileceğini ayrıntılarıyla anlatan bir protokolü açıklıyoruz.
Sonodinamik tedavi (SDT), sonikasyon sırasında artan hassasiyet için tümörleri hazırlamak için bir sonosensitize edici ajan sağlayan odaklanmış ultrason (FUS) uygulamasıdır. Ne yazık ki, glioblastoma (GBM) için mevcut klinik tedaviler eksiktir ve bu da hastalar arasında düşük uzun süreli sağkalım oranlarına yol açmaktadır. SDT, GBM’yi etkili, invaziv olmayan ve tümöre özgü bir şekilde tedavi etmek için umut verici bir yöntemdir. Sonosensitizatörler, çevredeki beyin parankimine kıyasla tercihen tümör hücrelerine girerler. Bir sonosensitize edici ajanın varlığında FUS uygulaması, apoptozla sonuçlanan reaktif oksidatif türler üretir. Bu tedavinin daha önce klinik öncesi çalışmalarda etkili olduğu gösterilmiş olsa da, belirlenmiş standart parametrelerin eksikliği vardır. Bu terapötik stratejiyi klinik öncesi ve klinik kullanım için optimize etmek için standartlaştırılmış yöntemler gereklidir. Bu yazıda, manyetik rezonans kılavuzluğunda FUS (MRgFUS) kullanarak klinik öncesi bir GBM kemirgen modelinde SDT gerçekleştirme protokolünü detaylandırıyoruz. MRgFUS, invaziv ameliyatlara (örneğin kraniotomi) gerek kalmadan bir beyin tümörünün spesifik olarak hedeflenmesine izin verdiği için bu protokolün önemli bir özelliğidir. Burada kullanılan tezgah üstü cihaz, bir MRI görüntüsündeki bir hedefe tıklayarak üç boyutlu olarak belirli bir konuma odaklanabilir ve bu da hedef seçimini basit bir süreç haline getirir. Bu protokol, araştırmacılara MRgFUS SDT için standartlaştırılmış bir klinik öncesi yöntem sağlayacak ve translasyonel araştırma için parametreleri değiştirme ve optimize etme esnekliği sağlayacaktır.
Glioblastoma (GBM), 100.000 kişide 3.21 insidansı olan ve en sık görülen kötü huylu beyin tümörü olan oldukça agresif bir beyin kanseri türüdür1. Mevcut bakım standardı cerrahi rezeksiyon, radyasyon ve kemoterapiyi içerir2. Tümörün invaziv ve infiltratif doğası nedeniyle, tam tümör rezeksiyonu nadirdir. Tümör sınırlarında rezidüel doku, yüksek oranda tümör nüksü ve 5 yıl sonra %6’dan az düşük sağkalım oranı ile sonuçlanır1.
Bu prognoz nedeniyle, araştırmacılar bu ölümcül hastalıkla mücadele etmek için yeni terapötik seçenekleri araştırıyorlar. Sonodinamik tedavi (SDT), hedeflenen hücrelerde sitotoksik bir etki oluşturmak için düşük yoğunluklu odaklanmış ultrason (FUS) ve sonosensitize edici ajanları birleştiren noninvaziv bir tedavidir3. Örnek olarak, 5-aminolevulinik asit (5-ALA) gibi porfirin bazlı sonosensitizörler tercihen tümör hücreleri tarafından alınır ve odaklanmış ultrasona maruz kaldıklarında reaktif oksidatif türlerin (ROS) üretimini zarar verici seviyelere çıkarır. Hücrelerde aşırı eksprese edilen ROS seviyeleri, hücresel yapılara zarar verebilir ve apoptozu tetikleyebilir. 5-ALA tercihen tümör hücreleri tarafından alındığından, tedavi bölgesindeki sağlıklı doku zarar görmez 3,4. Ön in vitro çalışmalar, birçok kanser hücresinin SDT tedavisi ile parçalandığını, ancak hücre ölüm oranının hücre hattına bağlı olduğunu ortaya koymuştur. Ön in vivo çalışmalar, SDT’nin apoptozu tetikleyebileceğini doğrulayan benzer sonuçlar vermektedir5.
Bu protokol, bir tezgah üstü FUS araştırma platformu kullanarak intrakraniyal olarak implante edilmiş GBM hücreleri ile kemirgen modellerinin SDT tedavisi için etkili teknikleri ve parametreleri tanımlamayı amaçlamaktadır. Araştırmacılar, translasyonel FUS araştırması için SDT’yi gerçekleştirmek ve optimize etmek için bu protokolü kullanabilir.
GBM’li hastalar için yeni terapötik ve etkili tedavi seçenekleri gereklidir. Bu protokol, şu anda klinik çeviri için kapsamlı araştırmalardan geçmekte olan GBM için klinik öncesi FUS aracılı bir tedavinin ana hatlarını çizmiştir. SDT heyecan verici bir potansiyele sahip olsa da, klinik öncesi ortamda anlaşılması ve optimize edilmesi gereken çok şey var.
Bu protokolün en önemli bileşenlerinden biri, maksimum etkinlik için tümörü hedeflemek için MR kılavuzluğunda FUS kullanmaktır. Bir fantom kullanılarak, eksenel MRI dilimlerinin her pikseline bir koordinat atanabilen bir 3D koordinat alanı oluşturulabilir. Daha sonra, MR görüntüsündeki sonikasyon konumunu seçmenin basit bir prosedürü, dönüştürücünün nereye hedefleneceğini bildirir. Kullanılan klinik öncesi FUS sistemi çok yönlüdür ve görüntüleme onayı olmadan hedeflenmesi zor olan daha derin yerleşimli tümörler de dahil olmak üzere tümör gibi spesifik patolojilerin yerlerini hedeflemeye ihtiyaç duyulduğunda uygulanabilir. Gadolinyumun kontrast madde olarak kullanılması, tümörün net bir şekilde görselleştirilmesi ve kullanıcının hedefleri seçerken bilinçli kararlar vermesine olanak tanır. SDT’nin diğer birçok tedaviye göre avantajı, tümöre özgü bir tedavi olmasıdır. Düşük yoğunluklu FUS sadece tümör dokusunu hedef almalı, sağlıklı beyin parankimini nispeten el değmeden bırakmalıdır 3,8.
Bu deneyin sonuçları, bu protokolün avantajlarının SDT için literatürdeki diğer bulgulara benzer terapötik sonuçlara nasıl yol açabileceğini vurgulamaktadır. Şekil 5 , tedavi gününü takip eden 24 saat gibi kısa bir süre içinde, tedavi edilen kohortta tümör büyümesinde bir yavaşlama olduğunu göstermektedir. Bu küçük örneklem büyüklüğü kullanılarak önemsiz olsa da, anlamlılık daha fazla sayıda hayvanla sonuçlanabilir. Tümör büyümesindeki bu gecikme, Wu ve ark. (2019), tedavi edilen hayvanlarda zaman içinde tümör büyümesinin yavaşladığını ve hayatta kalma sürelerinin arttığını göstermiştir9.
Bu protokol tasarlanırken göz önünde bulundurulması gereken hususlar arasında hayvan suşu, tümör tipi ve sonosensitize edici ajan seçimi yer alıyordu. Bu protokol için birçok nedenden dolayı atimik çıplak fareler seçildi. İlk olarak, çıplak farenin sonikasyonu daha kolaydır, çünkü saç eksikliği herhangi bir zayıflamayı önler. Ayrıca, bir bağışıklık sisteminin olmaması, hasta kaynaklı ksenogreftlerin (PDX’ler) implantasyonuna izin verir, böylece tümör modeli klinik duruma daha çok benzer. Atimik bir model kullanmanın dezavantajı, bağışıklık sisteminin karakterize edilememesidir, bu nedenle bu çalışmalarda SDT tarafından üretilen herhangi bir bağışıklık tepkisi ölçülmeyecektir10. Seçilen tümör hattı agresif ve hızlı büyüyen bir PDX hattıdır. Tedavi zamanı çok önemlidir çünkü tümörün oluşumu doğrulanmalıdır, ancak tümör yükü kraniyal hemisferi doldurmamalıdır. Farklı hücre hatları, klinik öncesi deneyler için en uygun boyutta bir tümör elde etmek için farklı inkübasyon süreleri gerektirir. Bu protokolde, önceki deneylerde (yayınlanmamış veriler) bu hücre hattı için in vitro olarak doğrulanan GBM tümörlerinde tercihli alımı nedeniyle sonosensitizer olarak 5-ALA kullanılmıştır. Etkinlik ve güvenlik için en uygun bileşiği belirlemek için diğer sonosensitizörler ikame edilebilir ve test edilebilir. Son olarak, 5-ALA enjeksiyonundan 3 saat sonra tedaviye başlandı, çünkü önceki literatür bunun bu enjeksiyon dozu ile en uygun zamanolduğunu göstermiştir 5.
Bu protokolde seçilen FUS parametrelerine (her hedef konumda 515 kHz’de 2 dakika boyunca 10 W/cm2), önceki literatürün gözden geçirilmesine ve ilk deneylere(4,9) dayalı olarak karar verilmiştir. Tüm tümör boyunca ROS etkisini oluşturmak için tüm tümörü kapsayan bir sonikasyon noktaları ızgarası seçildi. Burada kullanılan yoğunluk diğer yayınlardan daha yüksektir, ancak kısa bir zaman aralığında, 25 W/cm2’ye kadar olan yoğunluklar bir fare modelinde önemli yan etkiler olmaksızın başarıyla kullanıldığından, bunun sıcaklıkla ilgili herhangi bir olumsuz etkiye yol açması beklenmemektedir11. Daha da önemlisi, literatürde standartlaştırılmış veya optimize edilmiş bir FUS parametresi seti yayınlanmamıştır. Bu nedenle, burada rapor edilen spesifik değerler, optimal parametre setini belirlemek için ayarlanabilir, bu da güvenliği korurken tümör dokusunun maksimum azalmasına yol açar. Ek olarak, farklı hücre hatları farklı seviyelerde vaskülarizasyon ve hipoksiye sahip olduğundan, bu tedavinin ayarlanması gerekebilir. SDT tedavisinden sonraki 24 saat içinde genel olarak tümör büyümesinin azaldığını gösterdik (Şekil 5), ancak parametrelerin optimize edilmesi ve bu tedavinin maksimum etkisini belirlemek için daha fazla hayvanın test edilmesi gerekiyor. Tedavi sonrası MRG taramaları, tümör dokusuna lokalize etki ile sağlıklı dokuda FUS tedavisi ile oluşturulan lezyonların görünümünü göstermez (Şekil 6). Tümörde 5-ALA alımını en üst düzeye çıkarmak için SDT’yi kan-beyin bariyerini geçici olarak geçirgen hale getirmek gibi diğer FUS teknikleriyle birleştirme fırsatı da vardır12. Bu protokol, yapısal düzeyde güvenlik ve etkinliği kontrol etmek için çeşitli histoloji teknikleri uygulanarak daha da desteklenebilir. Yapısal veya tümör hasarını kontrol etmek için bir hematoksilen ve eozin (H & E) boyası yapılabilir13, hücresel apoptozu kontrol etmek için bir terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP nick ucu etiketleme (TUNEL) boyasıyapılabilir 14. Ne olursa olsun, bu protokol, SDT ile tedavi edilen tümörlerin büyüme hızının ve tedavi edilmemiş tümörlerin büyüme hızının karşılaştırılmasının yanı sıra sonikasyondan önce ve sonra tümör dilimlerinin karşılaştırılmasıyla belirgin olan, tedaviden 24 saat sonra bile değişikliklerin fark edildiği güvenli ve tümöre özgü bir tedavi sunar.
Herhangi bir protokolde, her zaman tartılması gereken dezavantajlar veya sınırlamalar vardır. Mevcut protokolün ana sınırlaması zaman ve masraftır. Bu arada, bu protokolün avantajlarından biri de otomatik odaklı amacıdır. Bu odaklanmış prosedürü gerçekleştirmek için, tümörün hedeflenmesinin doğru olduğundan emin olmak için her bir hayvan için MRI taramalarının yapılması gerekir, bu hem zaman alıcı hem de pahalı olabilen bir süreçtir. Ek olarak, istenen odak noktalarının sayısına bağlı olarak, bu protokolü gerçekleştirmek için gereken süre sadece birkaç hayvan için bile saatler olabilir ve bu da deney hayvanı sayılarının düşük olmasına neden olabilir. Bu dezavantajlara rağmen, bu hedefe yönelik noninvaziv protokol, açık cerrahi seçeneklerle karşılaştırıldığında uygulanabilir bir tercih olmaya devam etmektedir.
Sonuç olarak, bu protokol, SDT tedavisinin tedaviden sonraki 24 saat içinde beyindeki tümör büyümesini azaltma yeteneğini gösterirken, klinik öncesi bir fare modelinde sağlıklı nöral dokuyu korudu. Bu tedaviyi klinik olarak uygun hale getirmek için SDT’nin etkinliği ve ROS üretimini artırmak için çeşitli parametrelerin optimize edilmesi üzerine çalışmalar gereklidir. SDT’nin noninvaziv bir terapötik model olarak kullanımı için yeni yollar araştırılmalıdır.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, Ulusal Bilim Vakfı (NSF) STTR Faz 1 Ödülü’nden (#: 1938939), ASME Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı (DARPA) Ödülü (#: N660012024075) ve Johns Hopkins Klinik ve Translasyonel Araştırma Enstitüsü’nün (ICTR) Klinik Araştırma Akademisyenleri Programı (KL2), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi (NCATS) tarafından yönetilmektedir. Hücreler, Mayo Tıp Eğitimi ve Araştırma Vakfı’ndan satın alındı ve sağlandı.
0.5% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
1 mL Syringes | BD | 309597 | |
10 µL Hamilton syringe | Hamilton Company | 49AL65 | |
10 µL Pipette tips | USAScientific | ||
1000 mL Flask | Corning | MP-34514-25 | |
15 mL conical tubes | Corning | CLS430791 | |
200 Proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
5 mL pipettes | Falcon | 357543 | |
50 mL Conical tubes | Corning | 430290 | |
500 mL filter | Corning | 431097 | |
5-Aminolevulinic acid hydrochloride | Research Products International | A11250 | |
7T PET-MR system | Bruker | Biospec 70/30 | |
Aluminum foil | Reynolds Brand | ||
Amplifier | FUS Instruments | 2175 | |
Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 | |
Bone drill | Foredom | HP4-917 | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004261 | |
Charcoal isoflourane waste container | Patterson scientific | 78909457 | |
Computer | FUS Instruments | 2269 | |
Cover glass | Fisherbrand | 12-545J | |
Desktop monitor | ASUS | VZ239H | |
D-Luciferin | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
Electronic shaver | Wahl | 93235-002 | |
Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
Formalin | Thermo Fisher Scientific | SF100-20 | |
Function generator | Siglent | QS0201X-E01B | |
Gadolinium contrast agent (Gadavist) | McKesson Corporation | 2068062 | |
Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
Heat lamp | |||
Heat pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-12 | |
Induction chamber | Patterson scientific | 78933388 | |
Isofluorane vaporizer | Patterson scientific | 78916954 | |
Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
Isoflurane system | Patterson Scientific | 78935903 | |
IVIS spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
Lightfield microscope | BioTek | Cytation 5 | |
Nair | Church and Dwight Co. | 42010553 | |
Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
P-20 pippette | Rainin | 17008650 | |
Patient derived xenographs | Mayo Klinik | M59 | |
Penicillin/Streptomyosin | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 70-011-069 | |
Pippetter | Drummond | 4-000-101 | |
Povidone-iodine | Covetrus | PI050CV | |
RK-50 MRgFUS system | FUS Instruments | 2182 | |
Scale | |||
Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
Screwdriver set | Jakemy | JM-8160 | |
Skin marker | Time Out | D538,851 | |
Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
Stapler | MikRon | ACA9MM | |
Staples | Clay Adams | 427631 | |
Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5000 | |
Stereotactic MRI prototype plastic imaging fixture | FUS Instruments | ||
T-25 culture flask | Corning | 430641U | |
Transducer and matching box | FUS Instruments | T515H750-118 | |
Ultrasonic degasser | FUS Instruments | 2259 | |
Ultrasound gel | ParkerLabs | 01-08 | |
Water bath | FUS Instruments | ||
Xylazine | Covetrus | 1XYL006 |