Özet

Non-İnvaziv Kompresyona Bağlı Ön Çapraz Bağ (ACL) Yaralanması ve Farelerde Proteaz Aktivitesinin İn vivo Görüntülenmesi

Published: September 29, 2023
doi:

Özet

Non-invaziv ÖÇB yaralanması, farelerde travma sonrası osteoartriti (PTOA) başlatmak için güvenilir ve klinik olarak anlamlı bir yöntemdir. Bu yaralanma yöntemi aynı zamanda, proteazla aktive edilebilen yakın kızılötesi problar ve floresan yansıma görüntüleme kullanılarak yaralanma sonrası erken zaman noktalarında eklemdeki proteaz aktivitesinin in vivo olarak ölçülmesine izin verir.

Abstract

Ön çapraz bağ (ÖÇB) rüptürü veya menisküs yırtıkları gibi travmatik eklem yaralanmaları genellikle yaralanmayı takip eden 10-20 yıl içinde travma sonrası osteoartrite (PTOA) yol açar. Eklem yaralanmaları tarafından başlatılan erken biyolojik süreçleri anlamak (ör., inflamasyon, matriks metalloproteinazlar (MMP’ler), katepsin proteazları, kemik rezorpsiyonu) PTOA’nın etiyolojisini anlamak için çok önemlidir. Bununla birlikte, bu biyolojik süreçlerin in vivo ölçümü için çok az seçenek vardır ve OA’yı başlatmak için invaziv cerrahi teknikler veya enjeksiyonlar kullanılırsa erken biyolojik yanıtlar karıştırılabilir. PTOA çalışmalarımızda, farelerde non-invaziv kompresyona bağlı ACL hasarını takiben in vivo proteaz aktivitesini ölçmek için floresan yansıma görüntüleme (FRI) ile birlikte ticari olarak temin edilebilen yakın kızılötesi proteaz aktive edilebilir problar kullandık. Bu non-invaziv ÖÇB yaralanma yöntemi, klinik olarak ilgili yaralanma koşullarını yakından özetler ve cildi veya eklem kapsülünü bozmayı içermediğinden tamamen aseptiktir. Bu yaralanma ve görüntüleme yöntemlerinin kombinasyonu, travmatik bir eklem yaralanmasını takiben proteaz aktivitesinin zaman akışını birden fazla zaman noktasında incelememizi sağlar.

Introduction

Osteoartrit, Amerika Birleşik Devletleri’nde milyonlarca insanı etkileyen yaygın bir sağlık sorunudur1. Travma sonrası osteoartrit (PTOA), ön çapraz bağ (ÖÇB) yırtılması, menisküs yaralanması veya eklem içi kırık gibi bir eklem yaralanması ile başlayan bir OA alt kümesidir2. PTOA olarak sınıflandırılabilecek semptomatik OA hastalarının oranı en az %12’dir3 ve bu etiyoloji tipik olarak idiyopatik OA’dan daha genç bir popülasyonuetkiler4. OA’nın fare modelleri, hastalık etiyolojisini ve potansiyel OA tedavilerini çok daha kısa bir zaman çizelgesinde (insanlarda 10-20 yıla kıyasla fare modellerinde 4-12 hafta) araştırmak için çok önemli araçlardır. Bununla birlikte, farelerde OA’yı başlatma yöntemleri genellikle ACL transeksiyonu 5,6, medial menisküs 5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 veya ikisinin bir kombinasyonu gibi invaziv cerrahi teknikleri içerir 17,18,19, klinik olarak ilgili yaralanma koşullarını yeniden üretmez. Cerrahi modeller ayrıca eklem kapsülünün bozulması nedeniyle eklemdeki iltihabı şiddetlendirir ve bu da OA ilerlemesini hızlandırabilir.

Non-invaziv diz yaralanması fare modelleri, yaralanma sonrası erken zaman noktalarında biyolojik ve biyomekanik değişiklikleri inceleme fırsatı sağlar ve klinik olarak daha anlamlı sonuçlar verebilir20. Laboratuvarımız, farelerde ön çapraz bağ (ACL) rüptürünü indüklemek için harici olarak uygulanan tek bir tibial kompresyon aşırı yüklemesini kullanan non-invaziv bir yaralanma modeli oluşturmuştur 21,22,23,24. Bu non-invaziv yaralanma yöntemi, cildi veya eklem kapsülünü bozmadan aseptik bir eklem yaralanması üretebilir.

Floresan yansıma görüntüleme (FRI), belirli bir dalga boyunda kızılötesi ışıkla bir hedefi uyarmayı ve başka bir dalga boyunda yayılan yansıyan ışığı ölçmeyi içeren bir optik görüntüleme yöntemidir. Ticari olarak temin edilebilen proteaza özgü problar hayvan modellerine enjekte edilebilir ve FRI daha sonra diz eklemi gibi belirli bölgelerde proteaz aktivitesini ölçmek için kullanılabilir. Bu yöntem, inflamasyon gibi biyolojik aktivitelerin in vivo tespiti için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu uygulama için kullanılan problar, ilgili proteazlarla karşılaşana kadar floresan olarak söndürülür. Bu proteazlar daha sonra problar üzerindeki bir enzim bölünme bölgesini kıracak ve ardından yakın kızılötesi bir floresan sinyali üreteceklerdir. Bu problar ve bu görüntüleme yöntemi, kanser 25,26,27,28 ve ateroskleroz29,30,31,32 çalışmalarında kapsamlı bir şekilde doğrulanmış ve kullanılmıştır ve grubumuz bunları inflamasyon ve matris bozulması belirteçlerini ölçmek için kas-iskelet sistemi çalışmaları için kullanmıştır 23,24,33.

Birlikte, in vivo FRI ve proteaz aktive edilebilir problarla birleştirilmiş non-invaziv eklem yaralanması, travmatik bir eklem yaralanmasını takiben inflamasyonu ve proteaz aktivitesini izlemek için benzersiz bir yetenek sağlar. Bu analiz, yaralanmadan saatler hatta dakikalar sonra yapılabilir ve aynı hayvan, eklemdeki proteaz aktivitesinin zaman seyrini incelemek için birden çok kez değerlendirilebilir. Daha da önemlisi, bu görüntüleme yöntemi, OA’nın cerrahi modelleriyle birleştirildiğinde mümkün olmayabilir, çünkü cildin ve eklem kapsülünün bozulması, eklem içinden gelen sinyali karıştıracak bir floresan sinyaline neden olur.

Protocol

Açıklanan tüm prosedürler, California Davis Üniversitesi’ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu çalışma için 3 aylık erkek C57BL/6J fareler kullanıldı. 1. Non-invaziv ACL yaralanması NOT: Harici olarak uygulanan bir basınç yükü tarafından üretilen ÖÇB yaralanması, insanlarda ÖÇB yaralanma koşullarını yakından özetleyen basit ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Bu protokol, ti…

Representative Results

3 aylık erkek C57BL / 6J farelerinin alt bacaklarına tek bir sıkıştırma kuvveti (yaralanmaya kadar 1 mm / s) uygulandıktan sonra, tüm farelerde sürekli olarak ACL yaralanması indüklendi. Diz yaralanmasında ortalama basınç kuvveti yaklaşık 10 N idi (Şekil 1). FRI analizi, yaralanmadan 7 gün sonra non-invaziv ACL hasarına maruz kalan farelerin yaralı eklemlerinde önemli ölçüde daha fazla proteaz aktivitesi gösterdi (Şek…

Discussion

Bu protokol, farelerdeACL hasarını indüklemek için tekrarlanabilir, invaziv olmayan bir yöntem oluşturmuş ve titizlikle tanımlamıştır 20,21,24,33. Bu basit ve etkili yaralanma yöntemi sadece birkaç dakika içinde gerçekleştirilebilir, bu da PTOA’nın yüksek verimli çalışmalarını kolaylaştırır. Bu yaralanma yöntemi aynı zamanda insan ACL yaralanması ile ilgili yaralanm…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin bir parçası olan Ulusal Artrit ve Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü tarafından R01 AR075013 Ödül Numarası altında desteklenmiştir.

Materials

10x Phosphate-Buffered Saline Tissue Protech PBS01-32R or equivalent
Air Anesthetia System Isoflurane vaporizor with induction chamber and nose cone
Buprenorphine Analgesic post-injury 
Depilatory Cream Veet B001KYPZ4G or equivalent
Fixtures Custom-made knee fixture, ankle fixture, and platform
IVIS Spectrum Perkin Elmer 124262 Can also use comparable optical imaging system
Kimwipes Kimberly-Clark Corporation 06-666 or equivalent
Living Image software  Perkin Elmer
Materials testing systems  TA Instruments Electroforce 3200 or equivalent
ProSense680 Perkin Elmer NEV10003 Can also use other probes such as OsteoSense, MMPSense, Cat K, AngioSense, etc.
Sterile Syringe with Needle Spectrum Chemical Mfg. Corp. 550-82231-CS Covidien 1 mL TB Syringe with 28 G x 1/2 in. Needle, Sterile or equivalent
Uniaxial load cell TA Instruments 20 N capacity
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, Inc. SI-0236 or equivalent
WinTest software  TA Instruments compatible with Electroforce 3200

Referanslar

  1. Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research (Hoboken. 68 (12), 1743-1750 (2016).
  2. Carbone, A., Rodeo, S. Review of current understanding of post-traumatic osteoarthritis resulting from sports injuries. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 397-405 (2017).
  3. Thomas, A. C., Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Palmieri-Smith, R. M. Epidemiology of posttraumatic osteoarthritis. Journal of Athletic Training. 52 (6), 491-496 (2017).
  4. Wang, L. J., Zeng, N., Yan, Z. P., Li, J. T., Ni, G. X. Post-traumatic osteoarthritis following ACL injury. Arthritis Research & Therapy. 22 (1), 57 (2020).
  5. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  6. Kamekura, S. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
  7. Ma, H. L., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
  8. Malfait, A. M., et al. ADAMTS-5 deficient mice do not develop mechanical allodynia associated with osteoarthritis following medial meniscal destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 18 (4), 572-580 (2010).
  9. Yang, S., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha is a catabolic regulator of osteoarthritic cartilage destruction. Nature Medicine. 16 (6), 687-693 (2010).
  10. Moodie, J. P., Stok, K. S., Muller, R., Vincent, T. L., Shefelbine, S. J. Multimodal imaging demonstrates concomitant changes in bone and cartilage after destabilisation of the medial meniscus and increased joint laxity. Osteoarthritis Cartilage. 19 (2), 163-170 (2011).
  11. Li, J., et al. Knockout of ADAMTS5 does not eliminate cartilage aggrecanase activity but abrogates joint fibrosis and promotes cartilage aggrecan deposition in murine osteoarthritis models. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 516-522 (2011).
  12. Shapiro, F., Glimcher, M. J. Induction of osteoarthrosis in the rabbit knee joint. Clinical Orthopaedics and Related Research. 147, 287-295 (1980).
  13. Meacock, S. C., Bodmer, J. L., Billingham, M. E. Experimental osteoarthritis in guinea-pigs. Journal of Experimental Pathology (Oxford). 71 (2), 279-293 (1990).
  14. Armstrong, S. J., Read, R. A., Ghosh, P., Wilson, D. M. Moderate exercise exacerbates the osteoarthritic lesions produced in cartilage by meniscectomy: a morphological study. Osteoarthritis Cartilage. 1 (2), 89-96 (1993).
  15. Pastoureau, P., Leduc, S., Chomel, A., De Ceuninck, F. Quantitative assessment of articular cartilage and subchondral bone histology in the meniscectomized guinea pig model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 11 (6), 412-423 (2003).
  16. Wancket, L. M., et al. Anatomical localization of cartilage degradation markers in a surgically induced rat osteoarthritis model. Toxicologic Pathology. 33 (4), 484-489 (2005).
  17. Karahan, S., Kincaid, S. A., Kammermann, J. R., Wright, J. C. Evaluation of the rat stifle joint after transection of the cranial cruciate ligament and partial medial meniscectomy. Comparative Medicine. 51 (6), 504-512 (2001).
  18. Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society. 13 (7), 632-641 (2005).
  19. Jones, M. D., et al. In vivo microfocal computed tomography and micro-magnetic resonance imaging evaluation of antiresorptive and antiinflammatory drugs as preventive treatments of osteoarthritis in the rat. Arthritis & Rheumatology. 62 (9), 2726-2735 (2010).
  20. Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).
  21. Christiansen, B. A., et al. Musculoskeletal changes following non-invasive knee injury using a novel mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 20 (7), 773-782 (2012).
  22. Lockwood, K. A., Chu, B. T., Anderson, M. J., Haudenschild, D. R., Christiansen, B. A. Comparison of loading rate-dependent injury modes in a murine model of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 32 (1), 79-88 (2014).
  23. Satkunananthan, P. B., et al. In vivo fluorescence reflectance imaging of protease activity in a mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 22 (10), 1461-1469 (2014).
  24. Hsia, A. W., et al. Post-traumatic osteoarthritis progression is diminished by early mechanical unloading and anti-inflammatory treatment in mice. Osteoarthritis Cartilage. 29 (12), 1709-1719 (2021).
  25. Zhang, H., et al. Biochromoendoscopy: molecular imaging with capsule endoscopy for detection of adenomas of the GI tract. Gastrointestinal Endoscopy. 68 (3), 520-527 (2008).
  26. Gounaris, E., et al. Live imaging of cysteine-cathepsin activity reveals dynamics of focal inflammation, angiogenesis, and polyp growth. PLoS One. 3 (8), e2916 (2008).
  27. Sheth, R. A., Mahmood, U. Optical molecular imaging and its emerging role in colorectal cancer. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (4), G807-G820 (2010).
  28. Clapper, M. L., et al. Detection of colorectal adenomas using a bioactivatable probe specific for matrix metalloproteinase activity. Neoplasia. 13 (8), 685-691 (2011).
  29. Nahrendorf, M., et al. Dual channel optical tomographic imaging of leukocyte recruitment and protease activity in the healing myocardial infarct. Circulation Research. 100 (8), 1218-1225 (2007).
  30. Jaffer, F. A., et al. Optical visualization of cathepsin K activity in atherosclerosis with a novel, protease-activatable fluorescence sensor. Circulation. 115 (17), 2292-2298 (2007).
  31. Jaffer, F. A., Libby, P., Weissleder, R. Optical and multimodality molecular imaging: insights into atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (7), 1017-1024 (2009).
  32. Razansky, D., et al. Multispectral optoacoustic tomography of matrix metalloproteinase activity in vulnerable human carotid plaques. Molecular Imaging and Biology. 14 (3), 277-285 (2012).
  33. Hsia, A. W., et al. Osteophytes and fracture calluses share developmental milestones and are diminished by unloading. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 699-710 (2018).
  34. Blaker, C. L., Little, C. B., Clarke, E. C. Joint loads resulting in ACL rupture: Effects of age, sex, and body mass on injury load and mode of failure in a mouse model. Journal of Orthopaedic Research. 35 (8), 1754-1763 (2017).
  35. Murata, K., et al. Controlling joint instability delays the degeneration of articular cartilage in a rat model. Osteoarthritis Cartilage. 25 (2), 297-308 (2017).
  36. Murata, K., et al. Controlling Abnormal joint movement inhibits response of osteophyte formation. Cartilage. 9 (4), 391-401 (2018).
  37. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Laboratory Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  38. Kokubun, T., et al. Effect of changing the joint kinematics of knees with a ruptured anterior cruciate ligament on the molecular biological responses and spontaneous healing in a rat model. The American Journal of Sports Medicine. 44 (11), 2900-2910 (2016).
  39. Bhatti, F. U., et al. Characterization of non-invasively induced post-traumatic osteoarthritis in mice. Antioxidants (Basel). 11 (9), 1783 (2022).
  40. Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Laboratory Animals (NY). 37 (1), 26-32 (2008).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Lin, Y., Christiansen, B. A. Non-Invasive Compression-Induced Anterior Cruciate Ligament (ACL) Injury and In Vivo Imaging of Protease Activity in Mice. J. Vis. Exp. (199), e65249, doi:10.3791/65249 (2023).

View Video