Bir plazma membran reseptörü kinazının membran kaçakçılığı olaylarını incelemek için burada yaygın olarak kullanılan birkaç yöntem tanıtılmaktadır. Bu yazıda bitki materyali hazırlama, farmakolojik tedavi ve konfokal görüntüleme kurulumu dahil olmak üzere ayrıntılı protokoller açıklanmaktadır.
Ökaryotik hücrelerde, proteinler ve lipitler dahil olmak üzere zar bileşenleri, endomembran sistemi içindeki hedeflerine uzamsal olarak taşınır. Bu, yeni sentezlenen proteinlerin hücre yüzeyine veya hücrenin dışına salgı yoluyla taşınmasını, hücre dışı yüklerin veya plazma zarı bileşenlerinin hücre içine endositik taşınmasını ve yüklerin hücre altı organeller arasında geri dönüştürülmesini veya taşınmasını vb. içerir. Membran kaçakçılığı olayları, tüm ökaryotik hücrelerin gelişimi, büyümesi ve çevresel adaptasyonu için çok önemlidir ve bu nedenle sıkı düzenlemelere tabidir. Hücre dışı boşluktan ligand sinyallerini algılayan hücre yüzeyi reseptör kinazları hem salgı hem de endositik taşımaya uğrar. Plazma membranı lokalize lösin açısından zengin tekrar reseptör kinazı (ERL1) kullanarak membran kaçakçılığı olaylarını incelemek için yaygın olarak kullanılan yaklaşımlar burada açıklanmaktadır. Yaklaşımlar arasında bitki materyali hazırlama, farmakolojik tedavi ve konfokal görüntüleme kurulumu yer alır. ERL1’in uzay-zamansal regülasyonunu izlemek için bu çalışma, ERL1 ile bir multi-veziküler vücut belirteç proteini olan RFP-Ara7 arasındaki ko-lokalizasyon analizini, bu iki proteinin zaman serisi analizini ve membran kaçakçılığı inhibitörleri brefeldin A ve wortmannin ile tedavi edilen ERL1-YFP’nin z-yığın analizini açıklamaktadır.
Membran trafiği, proteinler, lipitler ve diğer biyolojik ürünler dahil olmak üzere membran bileşenlerini (kargolar olarak da bilinir) ökaryotik bir hücre içindeki farklı organeller arasında veya plazma zarı boyunca hücre dışı boşluğa ve hücre dışı boşluğadağıtan korunmuş bir hücresel süreçtir 1. Bu süreç, nükleer zar, endoplazmik retikulum, Golgi aygıtı, vakuol/lizozomlar, plazma zarı ve çoklu endozomlardan oluşan endomembran sistemi adı verilen bir zar ve organeller topluluğu tarafından kolaylaştırılır1. Endomembran sistemi, bu organeller arasında mekik dokuyan dinamik veziküller kullanarak membran bileşenlerinin değiştirilmesini, paketlenmesini ve taşınmasını sağlar. Membran kaçakçılığı olayları, hücre gelişimi, büyümesi ve çevresel adaptasyonu için çok önemlidir ve bu nedenle sıkı ve karmaşık düzenlemeleretabidir 2. Şu anda, moleküler biyoloji, kimyasal biyoloji, mikroskopi ve kütle spektrometresinde çoklu yaklaşımlar geliştirilmiş ve membran kaçakçılığı alanına uygulanmıştır ve endomembran sisteminin uzay-zamansal regülasyonunun anlaşılmasını büyük ölçüde ilerletmiştir 3,4. Moleküler biyoloji, ilgilenilen proteinin gen ekspresyonunun değiştirilmesi veya ilgilenilen proteinin belirli etiketlerle etiketlenmesi gibi, membran kaçakçılığına dahil olan varsayılan oyuncuların klasik genetik manipülasyonları için kullanılır. Kimyasal biyolojideki araçlar, belirli yolların trafiğine özel olarak müdahale eden moleküllerin kullanımını içerir 4,5. Kütle spektrometresi, biyokimyasal yaklaşımlarla mekanik olarak izole edilmiş bir organeldeki bileşenleri tanımlamak için güçlüdür 3,4. Bununla birlikte, membran trafiği dinamik, çeşitli ve karmaşık bir biyolojik süreçtir1. Canlı hücrelerde membran kaçakçılığı sürecini çeşitli koşullar altında görselleştirmek için ışık mikroskobu önemli bir araçtır. Olayların verimliliğini, kinetiğini ve çeşitliliğini ölçmedeki zorlukların üstesinden gelmek için gelişmiş mikroskop tekniklerinde sürekli ilerleme kaydedilmiştir4. Burada, bu çalışma, doğal olarak basitleştirilmiş ve deneysel olarak erişilebilir bir sistem olan stoma gelişim sürecinde membran kaçakçılığı olaylarını incelemek için kimyasal/farmakolojik biyoloji, moleküler biyoloji ve mikroskopide yaygın olarak benimsenen metodolojilere odaklanmaktadır.
Stomalar, iç hücreler ve çevre arasındaki gaz alışverişini kolaylaştırmak için açılıp kapanan bitki hava yüzeylerindeki mikro gözeneklerdir 6,7,8. Bu nedenle stomalar, bitkinin hayatta kalması ve büyümesi için çok önemli olan iki olay olan fotosentez ve terleme için gereklidir. Stoma gelişimi, bitkinin çevreye adaptasyonunu optimize etmek için çevresel ipuçlarıyla dinamik olarak ayarlanır9. 2002 yılındaki çalışmalara dayanan reseptör proteini Too Many Mouths’un (TMM) tanımlanması, model bitki Arabidopsis thaliana10’da stoma gelişiminin moleküler mekanizmalarını araştırmak için yeni bir çağın kapısını açtı. Sadece birkaç on yıl sonra, klasik bir sinyal yolu tanımlandı. Yukarı akıştan aşağı akışa kadar, bu yol, epidermal modelleme faktörleri (EFP) ailesinde bir grup salgı peptit ligandı, EREECTA (ER) ailesinde birkaç hücre yüzeyi lösin açısından zengin tekrar (LRR) reseptör kinazları, LRR reseptör proteini TMM, bir MAPK kaskad ve SUSKUN (SPCH), DILSIZ, FAMA ve SCREAM (SCRM) dahil olmak üzere birkaç bHLH transkripsiyon faktörü içerir11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Önceki çalışmalar, reseptör kinazlardan biri olan ER-LIKE 1’in (ERL1), EPF algısı20 üzerine aktif hücre altı davranışlar gösterdiğini göstermektedir. ERL2 ayrıca plazma zarı ile bazı hücre içi organeller arasında dinamik olarak trafik yapar27. Membran kaçakçılığı adımlarının bloke edilmesi, anormal stoma desenlenmesine neden olarak yaprak yüzeyinde stoma kümelerine neden olur28. Bu sonuçlar, membran trafiğinin stoma gelişiminde önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Bu çalışma, bazı membran kaçakçılığı inhibitörleri kullanılarak farmakolojik tedavi ile birlikte protein-protein hücre altı ko-lokalizasyon analizi kullanılarak ERL1 dinamiklerini uzay-zamansal olarak araştırmak için bir protokolü açıklamaktadır.
Endomembran sistemi, ökaryotik bir hücrenin sitoplazmasını farklı bölmelere ayırır ve bu da bu organellerin özel biyolojik işlevini sağlar. Kargo proteinlerini ve makromolekülleri nihai varış yerlerine doğru zamanda ulaştırmak için, çok sayıda vezikül bu organeller arasında mekik dokumak üzere yönlendirilir. Yüksek düzeyde düzenlenmiş membran kaçakçılığı olayları, hücrelerin canlılığında, gelişmesinde ve büyümesinde temel roller oynar. Bu önemli ve karmaşık süreci düzenleye…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı (IOS-2217757) (X.Q.) ve Arkansas Üniversitesi Tıp Bilimleri (UAMS) Bronson Vakfı Ödülü (H.Z.) tarafından desteklenmiştir.
10 mL syringes | VWR | BD309695 | Vacuum samples |
Brefeldin A (BFA) | Sigma | B7651 | membrane trafficking drug |
Confocal Microscope | Leica | Lecia SP8 TCS with LAS-X software package | Imaging |
Dissecting Forceps | VWR | 82027-402 | Genetic cross |
Fiji | NIH | https://imagej.net/Fiji | Image processing |
Leica LAS AF software | Leica | http://www.leica-microsystems.com | Image processing |
transgenic seeds of ERL1-YFP | Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020). | ||
transgenic seeds of RFP-Ara7 | Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011). | ||
Wortmannin (Wm) | Sigma | W1628 | membrane trafficking drug |