Retroorbital Ven Enjeksiyonunun Yenidoğan Kemirgen Modeli

Hayvan araştırmaları, klinik araştırmalara yol açan önemli bir adımdır ve bu nedenle, hayvan çalışmalarının klinik ortamda gerçekleştirilen prosedürleri ve tedavileri yakından taklit etmesi önemlidir. Bununla birlikte, klinik uygulamaların yenidoğan kemirgen çalışmalarına çevrilmesinde çeşitli zorluklar vardır. Bunlar, yenidoğan kemirgeninin küçük boyutunu ve diğerlerinin yanı sıra yetişkin araştırmalarına kıyasla yenidoğan araştırma ve bilgisindeki boşluğu içerir ^1,2.

İlaçlar veya hücreler gibi farklı maddelerin uygulanması, intraperitoneal (ip), subkutan (sc) ve intravenöz (iv) enjeksiyonlar dahil olmak üzere birden fazla yolla gerçekleştirilebilir. İv ile enjeksiyon, insan yenidoğanlarında bileşiklerin uygulanmasının tercihli yoludur. Yenidoğanlarda IV uygulama yolu, ilaçların sistemik dağılımını en üst düzeye çıkarması ve yüksek biyoyararlanıma sahip olması nedeniyle diğer yollara göre avantajlıdır ^3,4. Tekrarlanan ilaç uygulaması için bakımlı bir iv hatları kullanılabilir. Kemirgen çalışmalarında, iv enjeksiyonları kuyrukta, yüz/temporal damarlarda veya retroorbital sinüs^5'te yapılmalıdır. Kuyruk damarı enjeksiyonu,⁵ arasından seçim yapabileceğiniz iki lateral kaudal paralel damar sağladığı için yetişkin kemirgenlerde rutin olarak kullanılır. Bununla birlikte, bu damarlar, yenidoğanlarda kullanımlarını dışlayan küçük bir çapa sahiptir. Yenidoğan iv enjeksiyonlarının çoğu, doğum sonrası 0 (P0)-P2'den görülebildiği ve nispeten büyük hacimli bir uygulamaya izin verdiği için yüzeysel fasiyal / temporal vende gerçekleştirilmiştir⁵. Bununla birlikte, hayvan cilt rengini kazandığında bu yol P3⁶ civarında güvenilmez hale gelir, böylece yüzeysel yüz/temporal damarın yardımsız gözle görülmesini zorlaştırır. Yenidoğan transvers sinüs yoluyla uygulama iv bir çalışmada^{tanımlanmıştır 7}; ancak bu, transvers sinüsün üzerindeki cildin açılmasını ve bir mikroskop yardımıyla P0-P1'de AAV9'un enjekte edilmesini gerektirir.

Potansiyel bir tedaviyi araştırırken veya ilgili bir yenidoğan yaralanma modeli oluştururken, yenidoğan kemirgenlerinin insanlara kıyasla farklı organ gelişim zamanlamasına sahip olabileceğini göz önünde bulundurmak önemlidir. Protokolümüz, insanlar ve kemirgenler arasındaki yenidoğan merkezi sinir sistemi gelişimindeki farklılıklara dayanmaktadır. Örnek olarak, yeni doğan insan beyni terimi yaklaşık olarak bir P7 sıçan ve bir P10 fare beyni^8'e karşılık gelir. Retroorbital olarak enjekte edilen maddelerin dağılımı diğer iv bölgelerinkine benzer olduğundan, yüksek kan seviyelerine hızla ulaşıldığından, bunu uygun bir yol olarak görüyoruz. Bu teknik, P1-P2 farelerinde oftalmik venöz sinüse bileşikler enjekte eden^Yardeni ve meslektaşları tarafından iyi tanımlanmıştır 9. Mevcut protokolde, henüz gözlerini açmamış yaşlı yenidoğan kemirgenlerinde retroorbital enjeksiyonların gerçekleştirilmesi için basit ve uygulanabilir bir yöntem gösterilmektedir.

Bu protokolde listelenen tüm prosedürler İsveç Tarım Kurulu'na uygundur ve Göteborg Hayvan Etik Komitesi (825-2017 ve 2195-19) tarafından onaylanmıştır. C57BL / 6 fareleri ve Wistar sıçanları, 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsü ve yiyecek ve suya ücretsiz erişim ile şirket içinde yetiştirildi. Tüm deneysel prosedürler ARRIVE yönergelerini takip etti¹⁰.

1. Çalışma alanı kurulumu

1. Bu prosedür süresince, deney hayvanlarını baraj kafesinden toplayın ve ısıtılmış bir ped (35-37 ° C) üzerinde ayrı bir kafese yerleştirin.
   NOT: Bir ışık kaynağı (albino hayvanlar) kullanılıyorsa, hayvanın başının altına yerleştirilebilen ısı olmayan bir ışık kaynağı kullanılmalıdır.

2. İğne ve çözelti

1. 29-31 G'lik (yaklaşık 0,30 mm) bir iğne kullanın.
2. Doğru hacimler için, enjekte edilecek çözeltiyi pipetlenmiş bir hacimden hazırlayın.
   NOT: Her retroorbital sinüse maksimum 5 μL/g vücut ağırlığı enjekte edilmelidir.

3. Kurulum

1. Hayvanları düz bir yüzeye yerleştirin (Şekil 1A) yanal yaslanma (Şekil 1C).
2. Tüm vücut izofluran anestezisini indükleyin (% 5 indüksiyon,% 3 idame).
   NOT: Hayvanlar bir ağızlık kullanılarak anestezi altına alınmalıdır. Göz kapağı ve gözyaşı kanalı bölgesi kapatılmamalıdır (Şekil 1D).
3. Pençe çekme refleks yöntemini kullanarak anestezi derinliğini kontrol edin.
   NOT: İnvaziv bir prosedür olarak kabul edilmediğinden ameliyat öncesi analjezi gerekmez¹¹.

4. Enjeksiyon prosedürü

NOT: Mümkünse, venöz sinüsün görülmesini kolaylaştırmak için hayvanın başının altında bir ışık kaynağı kullanın (Şekil 1C) (Şekil 1E). Göz kapağı hala kapalı olduğu için enjekte edilen alanın sterilizasyonuna gerek yoktur.

1. Başı sağa bakacak şekilde, enjeksiyonu sağ retroorbital sinüse uygulayın (sağ elini kullanan operatör örneği).
2. İğneyi, eğim aşağı, göz yuvasının önüne yerleştirin - medial kantusun eşdeğeri, yaklaşık 40°'lik bir açıyla. Bu açı, iğnenin göz yörüngesinin arkasına yönlendirilmesini sağlar.
3. İğnenin 1 / 3'ünü (yaklaşık 2 mm) göz yörüngesinin arkasında bulunan retroorbital sinüs alanına ilerletin.
4. Nazik, pürüzsüz ve akıcı bir hareketle enjekte edin.
5. Geri akışı önlemek için iğneyi yavaşça çekmeden önce bir süre bekleyin.
   DİKKAT: Aspire etmeyin.
6. Kontaminasyonu önlemek için her hayvan için yeni bir steril şırınga kullanın.
   NOT: Berrak bir çözelti enjekte ederken, damar anlık olarak berraklaşmalıdır.

5. Enjeksiyon sonrası bakım

1. Yavruyu kurtarma kutusuna yerleştirin, korumalı bir ısıtma cihazında (35-37 °C) dinlendirin.
2. İyileşmeyi bekleyin ve yavruyu baraja geri göndermeden önce herhangi bir sıkıntı belirtisi olup olmadığını kontrol edin.
   NOT: Boya enjekte edilen uygulama hayvanları, IACUC onaylı protokollere göre derhal ötenazi yapılmalıdır.
   DİKKAT: Enjeksiyon sırasında göz şişerse, iğnenin venöz pleks içine sokulmadığı ve bunun yerine göz yörüngesinde olduğu anlamına gelir. Yenidoğan kafatası çok yumuşaktır, eğer iğne onu delerse, enjeksiyon meninkslere ve hatta beyin parankimine gidecektir.

Bu teknik, global anestezi için bir ağızlık ile düz bir yüzeyde gerçekleştirildi (Şekil 1A). Ağızlık, medial kantusa erişimi engellememelidir (Şekil 1B). Albino hayvanlarda, damarların görselleştirilmesine yardımcı olmak için hayvanın altına bir fiber optik ışık kaynağı yerleştirildi (Şekil 1B). İğne yaklaşık 40°'lik bir açıyla yerleştirildi ve medial kantusa yaklaşık 2 mm ilerletildi (Şekil 1C). Bir P5 albino sıçanına tripan mavisi boyanın enjeksiyonu, retroorbital sinüsteki boyanın net bir şekilde görüntülenmesini sağladı (Şekil 1C).

Bu protokolde tarif edilen retroorbital enjeksiyon tekniği, izleyici biotin-dekstran'ı (BDA, 10.000 Da) uygulamak için başarıyla kullanıldı12. Vasküler araştırmalarda görünür izleyicilerin kullanılması, örneğin, kan damarlarından radyoaktif sükroz ekstravazasyonunun kullanılmasına bir alternatif sağlayabilir ve aynı beyinlerin diğer histolojik ölçümler için kullanılmasını sağlayabilir12.

Son zamanlarda, germinal matriks kanamasının (GMH) yenidoğan sıçan modelini oluşturduk13. Kısaca, P5 Wistar sıçanlarına medial striatuma tek bir intrakraniyal 0.3 U kollajenaz VII enjeksiyonu yapıldı. GMH, germinal matriksteki damarların yırtılmasına neden olur ve erken beyin hasarı ve mortalitenin yaygın nedenlerinden biridir14. GMH modelini daha fazla karakterize etmek için, GMH'nin kan-beyin bariyeri fonksiyonu ve bütünlüğündeki etkilerini araştırmak için BDA izleyicisinin retroorbital enjeksiyonunu kullandık (Şekil 2)14.

Salin enjeksiyonlu kontrollerle karşılaştırıldığında (Şekil 2A), BDA izleyici14'ün başarılı retroorbital enjeksiyonu, BDA enjeksiyonundan 10 dakika sonra beyin damar sistemindeki izleyici varlığının değerlendirilmesine izin verdi (Şekil 2B). Bu teknik daha sonra GMH ile yaralanmış hayvanlarda bireysel kan damarı seviyesinde BDA'nın penumbra vasküler sızıntısını tespit etmek için kullanıldı (Şekil 2C, kırmızı oklar) ve daha sonra10 ölçülebilir.

Şekil 1: Tripan mavisi boya uygulamasından sonra kan damarlarının diyagram görünümü ile deney düzeneği. (A) Fiber optik ışık kaynağı olmadan (B) ve (C) anestezi kurulumu. (D) P10 C5BL / 6 farede tripan mavisi boyanın retroorbital enjeksiyonu. (E) Tripan mavisi boya enjeksiyonunu takiben P5 Wistar sıçanındaki kan damarlarının diyagram görünümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: BDA izleyicisinin dağılımını gösteren temsili beyin mikrografları. (A) Salin enjekte edilen kontrol hayvanlarında pozitif leke yok. (B) Beynin kan damarlarında (korteks) hayvan başına 2.0 - 2.5 mg'lık bir doz konsantrasyonunda salin içinde çözünmüş BDA izleyici görüldü. (C) GMH'yi (kırmızı oklar) takiben beyin parankimine sızan BDA izleyicisi. Ölçek çubuğu = 200 μm. Andersson ve ark., 202114'ten uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar, bu protokolün araştırılması, yazarlığı veya yayınlanması ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.