Özet

Kimerik Küçük Kodlamayan RNA için Hesaplamalı Analiz Eğitimi: Hedef RNA Dizileme Kitaplıkları

Published: December 01, 2023
doi:

Özet

Burada, in vivo RNA:RNA etkileşimlerinin incelenmesinde kullanılan kimerik RNA dizileme verilerini analiz etmek için bir biyoinformatik boru hattının kurulumunu ve kullanımını gösteren bir protokol sunuyoruz.

Abstract

MikroRNA’lar (miRNA’lar) gibi küçük kodlamayan RNA’ların (sncRNA’lar) hedef RNA’ları ile in vivo gen düzenleyici etkileşimlerinin anlaşılması, son yıllarda, kimerik RNA’ların oluşumu ve müteakip dizileme kütüphaneleri yoluyla sncRNA:hedef RNA etkileşimlerini yakalamak için çapraz bağlanmayı ve ardından ligasyonu kullanan biyokimyasal yaklaşımlarla ilerletilmiştir. Kimerik RNA diziliminden elde edilen veri kümeleri, miRNA tahmin yazılımından genom çapında ve önemli ölçüde daha az belirsiz girdi sağlarken, bu verileri anlamlı ve eyleme geçirilebilir bilgilere damıtmak ek analizler gerektirir ve hesaplama altyapısına sahip olmayan araştırmacıları caydırabilir. Bu rapor, giriş seviyesi hesaplama biyologlarını yeni bir açık kaynaklı yazılım aracı olan Küçük Kimerik RNA Analiz Boru Hattı’nı (SCRAP) kurma ve uygulama konusunda desteklemek için bir eğitim sağlar. Platform gereksinimleri, güncelleştirmeler ve işlem hattı adımlarının açıklaması ve önemli kullanıcı girişi değişkenlerinin işlenmesi sağlanır. Biyologların kimerik RNA dizileme yaklaşımlarından içgörü elde etmelerinin önündeki bir engeli azaltmak, düzenleyici sncRNA’nın keşfe dayalı araştırmalarına sıçrama tahtası yapma potansiyeline sahiptir: çoklu biyolojik bağlamlarda hedef RNA etkileşimleri.

Introduction

Küçük kodlamayan RNA’lar, farklılaşma ve gelişme, sinyal işleme ve hastalık 1,2,3 gibi çeşitli süreçlerde gen paketlerinden ekspresyonun koordinasyonunda transkripsiyon sonrası rolleri nedeniyle oldukça incelenmiştir. MikroRNA’lar (miRNA’lar) dahil olmak üzere gen düzenleyici küçük kodlamayan RNA’ların (sncRNA’lar) hedef transkriptlerini doğru bir şekilde belirleme yeteneği, hem temel hem de translasyonel seviyelerde RNA biyolojisi çalışmaları için önemlidir. miRNA tohum dizisi ile potansiyel hedefleri arasında beklenen tamamlayıcılıktan yararlanan biyoinformatik algoritmalar, miRNA:hedef RNA etkileşimlerinin tahmini için sıklıkla kullanılmıştır. Bu biyoinformatik algoritmalar başarılı olsa da, başka bir yerde gözden geçirildiği gibi, hem yanlış pozitif hem de yanlış negatif sonuçları barındırabilirler 4,5,6. Son zamanlarda, in vivo sncRNA:hedef RNA etkileşimlerinin in vivo çapraz bağlanması ve ardından sncRNA’yı tek bir kimerik RNA 4,5,7,8,9,10 oluşturmak üzere hedefine fiziksel olarak bağlamak için bir ligasyon adımının dahil edilmesi yoluyla açık ve yarı kantitatif olarak belirlenmesine izin veren çeşitli biyokimyasal yaklaşımlar tasarlanmış ve uygulanmıştır.. Kimerik RNA’lardan dizileme kitaplıklarının daha sonra hazırlanması, dizileme verilerinin hesaplamalı işlenmesiyle sncRNA:hedef RNA etkileşimlerinin değerlendirilmesine izin verir. Bu video, kimerik RNA dizileme kitaplıklarından sncRNA:hedef RNA etkileşimlerinin sağlam ve tekrarlanabilir analizine izin vermek için tasarlanmış, küçük kimerik RNA analiz boru hattı (SCRAP) olarak adlandırılan bir hesaplama işlem hattının kurulması ve kullanılması için bir eğitim sağlar6.

Bu eğitimin amacı, sncRNA’nın kimerik moleküler okumalarını sağlayan biyokimyasal yaklaşımlar yoluyla üretilen verilerin analizinin önündeki engelleri azaltarak, araştırmacılara tamamen tahmine dayalı biyoinformatik algoritmalara aşırı güvenmekten kaçınmalarında yardımcı olmaktır: hedef RNA etkileşimleri. Bu eğitim, giriş seviyesi hesaplamalı bilim insanlarına, hibritlerin çapraz bağlanması, ligasyonu ve dizilenmesi (CLASH) ve endojen Argonaute’ye bağlı RNA’ların kovalent ligasyonu (CLEAR-CLIP)7,9 dahil olmak üzere mevcut birkaç biyokimyasal protokol tarafından üretilebilen kimerik RNA dizileme verilerini analiz etmek için geliştirilmiş bir boru hattı olan SCRAP’ın kullanımı yoluyla rehberlik edecek pratik adımlar ve ipuçları sağlar.

SCRAP kullanımı, diğer hesaplama boru hatlarına kıyasla kimerik RNA dizileme verilerinin analizi için çeşitli avantajlar sunar6. Göze çarpan bir avantaj, boru hattındaki adımlar için genellikle özel ve/veya desteklenmeyen komut dosyalarına dayanan alternatif işlem hatlarına kıyasla, kapsamlı ek açıklaması ve boru hattı içindeki iyi desteklenen ve rutin olarak güncellenen biyoinformatik komut dosyalarına çağrıların dahil edilmesidir. Bu özellik, SCRAP’a istikrar kazandırarak, araştırmacıların boru hattını tanımalarını ve kullanımını iş akışlarına dahil etmelerini daha değerli hale getirir. SCRAP’in ayrıca, önceki bir yayındaayrıntılı olarak açıklandığı gibi, sncRNA:hedef RNA etkileşimlerinin tepe noktalarını çağırmada alternatif boru hatlarından daha iyi performans gösterdiği ve platformlar arası işlevselliğe sahip olduğu gösterilmiştir 6.

Bu eğitimin sonunda, kullanıcılar (i) SCRAP için platform gereksinimlerini öğrenebilecek ve SCRAP boru hatlarını kurabilecek, (ii) referans genomları kurabilecek ve SCRAP için komut satırı parametreleri ayarlayabilecek ve (iii) tepe çağrı kriterlerini anlayabilecek ve tepe çağrı ve tepe ek açıklaması gerçekleştirebilecektir.

Bu video, RNA biyolojisini inceleyen araştırmacıların, dizileme kütüphanesi hazırlığına yönelik tartışılan biyokimyasal yaklaşımlardan biri aracılığıyla elde edilen kimerik RNA dizileme verilerinde haberci RNA’lar gibi hedef RNA’larla sncRNA etkileşimlerini analiz etmek için hesaplama boru hattı SCRAP’ı nasıl kurabileceklerini ve en uygun şekilde nasıl kullanabileceklerini pratik olarak ayrıntılı olarak açıklayacaktır.

SCRAP bir komut satırı yardımcı programıdır. Genel olarak, aşağıdaki kılavuzu izleyerek, kullanıcının (i) SCRAP’ı (https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP) indirip yüklemesi, (ii) referans genomları kurması ve SCRAP’yi çalıştırması ve (iii) en yüksek çağrı ve açıklama gerçekleştirmesi gerekir.

Bu yordamdaki hesaplama adımlarıyla ilgili daha fazla ayrıntı https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP’da bulunabilir. Bu makale, giriş seviyesi hesaplama becerilerine sahip araştırmacıların kimerik RNA dizileme kitaplığı veri kümelerinde SCRAP yüklemesine, optimize etmesine ve kullanmasına izin vermek için kurulum ve arka plan bilgileri sağlayacaktır.

Protocol

NOT: Protokol, SCRAP kullanarak kimerik RNA dizileme kitaplıklarını analiz etmek için gereken yazılımın indirilmesi ve yüklenmesiyle başlayacaktır. 1. Kurulum SCRAP’ı kurmadan önce, analizler için kullanılacak makineye Git ve Miniconda bağımlılıklarını kurun. Git büyük olasılıkla zaten yüklüdür. Örneğin, Mac OSX platformunda, “git” yardımcı programının bu dizinde mevcut olduğunu ve yüklü olduğunu görmek için hangi git’i<…

Representative Results

CLEAR-CLIP9 kullanılarak hazırlanan daha önce yayınlanmış dizileme veri kümelerinde SCRAP’nin değiştirilmiş bir sürümü (rRNA filtrelemesi için modifikasyonları uygulayan SCRAP sürüm 2.0) tarafından tespit edilen sncRNA sonuçları: hedef RNA Şekil 2 ve Tablo 1’de gösterilmektedir. Kullanıcılar, SCRAP’de pik çağrısı ile yüksek güvenilirlikli etkileşimlerin izolasyonunu takiben meydana gelen intron bölgeleri ile nispi fraks…

Discussion

sncRNA:hedef RNA etkileşimlerinin analizi için SCRAP boru hattının kullanımına ilişkin bu protokol, hesaplamalı analize giren araştırmacılara yardımcı olmak için tasarlanmıştır. Eğitimin tamamlanmasının, giriş seviyesi veya daha fazla hesaplama deneyimine sahip araştırmacılara, bu boru hattının kurulumu ve kullanımı için gerekli adımlarda ve kimerik RNA dizileme kitaplıklarından elde edilen verileri analiz etmek için uygulamasında rehberlik etmesi beklenmektedir. Bu protokolün tamamlanm…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Boru hattının kurulumu ve uygulanmasını açıklamaya ilişkin kritik geri bildirimler için BH Powell ve WT Mills IV de dahil olmak üzere yararlı tartışmalar için Meffert laboratuvarı üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma Braude Vakfı ödülü, Maryland Kök Hücre Araştırma Fonu Lansman Programı, Blaustein Ağrı Araştırma ve Eğitim Vakfı ödülü ve NINDS RO1NS103974 ve NIMH RO1MH129292 tarafından MKM’ye desteklenmiştir.

Materials

Genomes UCSC Genome browser N/A https://genome.ucsc.edu/ or https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/
Linux Linux Ubuntu 20.04 or 22.04 LTS recommended
Mac Apple Mac OSX (>11)
Platform setup GitHub N/A https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md]
SCRAP pipeline GitHub N/A https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP
Unix shell Unix operating system bash >=5.0
Unix shell Unix operating system zsh (5.9 recommended)
Windows Windows WSL Ubuntu 20.04 or 22.04 LTS

Referanslar

  1. Morris, K. V., Mattick, J. S. The rise of regulatory RNA. Nature Reviews Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).
  2. Li, X., Jin, D. S., Eadara, S., Caterina, M. J., Meffert, M. K. Regulation by noncoding RNAs of local translation, injury responses, and pain in the peripheral nervous system. Neurobiology of Pain (Cambridge, Mass.). 13, 100119 (2023).
  3. Shi, J., Zhou, T., Chen, Q. Exploring the expanding universe of small RNAs. Nature Cell Biology. 24 (4), 415-423 (2022).
  4. Broughton, J. P., Lovci, M. T., Huang, J. L., Yeo, G. W., Pasquinelli, A. E. Pairing beyond the seed supports microRNA targeting specificity. Molecular Cell. 64 (2), 320-333 (2016).
  5. Grosswendt, S., et al. Unambiguous identification of miRNA:target site interactions by different types of ligation reactions. Molecular Cell. 54 (6), 1042-1054 (2014).
  6. Mills, W. T., Eadara, S., Jaffe, A. E., Meffert, M. K. SCRAP: a bioinformatic pipeline for the analysis of small chimeric RNA-seq data. RNA. 29 (1), 1-17 (2023).
  7. Helwak, A., Kudla, G., Dudnakova, T., Tollervey, D. Mapping the human miRNA interactome by CLASH reveals frequent noncanonical binding. Cell. 153 (3), 654-665 (2013).
  8. Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
  9. Moore, M. J., Zhang, C., Gantman, E. C., Mele, A., Darnell, J. C., Darnell, R. B. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
  10. Bjerke, G. A., Yi, R. Integrated analysis of directly captured microRNA targets reveals the impact of microRNAs on mammalian transcriptome. RNA. 26 (3), 306-323 (2020).
  11. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11 (1), 129 (2010).
  12. Moore, M. J., et al. miRNA-target chimeras reveal miRNA 3′-end pairing as a major determinant of Argonaute target specificity. Nature Communications. 6 (1), 8864 (2015).
  13. Travis, A. J., Moody, J., Helwak, A., Tollervey, D., Kudla, G. Hyb: a bioinformatics pipeline for the analysis of CLASH (crosslinking, ligation and sequencing of hybrids) data. Methods (San Diego, Calif.). 65 (3), 263-273 (2014).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Eadara, S., Li, X., Eiss, E. A., Meffert, M. K. Computational Analysis Tutorial for Chimeric Small Noncoding RNA: Target RNA Sequencing Libraries. J. Vis. Exp. (202), e65779, doi:10.3791/65779 (2023).

View Video