Orofasiyal kas fibroz modeli oluşturmak için fare masseter kasında donma yaralanması

Orofasiyal kaslar, çiğneme, konuşma, solunum ve yüz ifadesi gibi günlük fizyolojik aktivitelerde kritik öneme sahiptir¹. Konjenital orofasiyal deformitelerde ise bu kaslar atrofik ve fibrotik değişiklikler göstererek vücut sağlığının ve sosyal bilişin bozulmasına yol açar². Yüz rekonstrüktif cerrahisi ilk basamak tedavi olmaya devam etmektedir, ancak postoperatif hastaların %30-70 kadarı hala kas kaybı ve kas disfonksiyonundan muzdariptir ^3,4 Orofasiyal kas rejenerasyonunun başarısızlığı, tek başına ameliyatla düzeltilemeyen içsel faktörlere bağlanmıştır.

Orofasiyal kasların ortaya çıkışı, karmaşık omurgalı kafasına ve odacıklı kalbe^eşlik eden evrimsel bir yeniliktir ^5,6. Somitten türetilmiş uzuv muadillerinden farklı olarak, orofasiyal kaslar branş kemerinden^{kaynaklanır 7}. Bu filogenetik ve ontogenetik karakterler onları farklı rejeneratif davranışlara yatkın hale getirebilir⁸. Masseter (MAS) kasının, tibialis anterior (TA) kasının aynı derecede yaralanmaya maruz kaldıktan sonra tamamen yenilendiği sırada ciddi fibroz geliştirdiği bildirilmiştir ^1,9. Bununla birlikte, rejenerasyonun altında yatan mekanizma tam olarak anlaşılamamıştır.

Bu çalışmada, orofasiyal kas rejenerasyonunun araştırılmasını kolaylaştırmak için farelerin masseter kasının donma yaralanması modeli oluşturulmuştur. Fibroz fenotipini değerlendirmek için zaman noktası olarak yaralanmadan 14 gün sonrasını seçtik, çünkü iki kas arasında fark edilebilir ayrışmanın tespit edilebildiği en erken zaman noktasıydı. Yaralanmadan sonra MAS'ın tamamen yenilenmesi en az 40 hafta gerektirir¹. Tutarlı bir şekilde, bu çalışma, yaralanmadan 14 gün sonra TA'nın düzenli rejenerasyonuna kıyasla, MAS'ın donma yaralanmasını takiben kayda değer bir kollajen birikimi ortaya koymuştur. Bu modelin yardımıyla, kas atrofisi ve fibroz ile ilgili daha ileri mekanik çalışmalar yapılabilir ve bu da ameliyat sonrası orofasiyal kas rejenerasyonunu teşvik etmek için potansiyel terapötik yolların geliştirilmesine yardımcı olacaktır.

Bu çalışmadaki tüm hayvan prosedürleri, Sichuan Üniversitesi Batı Çin Stomatoloji Okulu Etik Komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı (WCHSIRB-D-2020-114). Erkek C57BL / 6 fareleri (5 haftalık) nem kontrollü (% 53 ± 2) ve sıcaklık kontrollü (23 ± 2 ° C) bir tesiste büyütüldü ve 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsündeydi. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Donma yaralanması

1. Anestezi: Fareleri izofluranla ıslatılmış pamuk topları ile sakinleştirin ve 50 mg / kg'lık bir dozda intraperitoneal olarak tiletamin-zolazepam enjekte edin. Ameliyat öncesi ve sonrası analjezi, 1 mg/kg dozunda intraperitoneal meloksikam enjeksiyonu ile sağlandı. Gözlerini veteriner merhemi ile koruyun. 38 ° C'de tutulan bir ısıtma yastığı, hayvana termal destek sağlamak için tüm prosedür boyunca cerrahi örtünün altına yerleştirildi. Fareleri ameliyat masasına yan yatırdıktan sonra yapışkan bantla sabitleyin (Şekil 1). Göz kapağı refleksi, düzeltme refleksi ve pedal çekme refleksi kaybı ile anestezinin yeterliliğini değerlendirin.
   NOT: İzofloran anestezisi uygularken, fareyi bir elinizle ve izofloranla ıslatılmış pamuk topunu diğer elinizle tutun. Rahatsızlık ve cilt tahrişini önlemek için pamuğu hayvandan uzak tuttuğunuzdan emin olun.
2. Ameliyat öncesi epilasyon: Farenin baldırındaki ve yüzündeki tüyleri tıraş etmek için elektrikli bir tıraş bıçağı kullanın ve tüy dökücü macunu pamuklu çubukla cilde uygulayın, masseter kasını ve tibialis ön kasını kaplayın. 1-2 dakika sonra macunu etanol bazlı cerrahi mendil ile yıkayın (Şekil 2A ve Şekil 2G). Cerrahi bölgeler üç tur iyot bazlı ovma ve% 75 etanol ile dezenfekte edildi.
   NOT: Elektrikli tıraş makinesi tek başına özellikle masseter bölgesinde epilasyon için yeterli değildi. Tüy dökücü macunu uygularken aşırı macun kullanmamak önemlidir. Cilt yanıklarını önlemek için macunu yıkarken cildi nazikçe silin.
3. Cerrahi alan maruziyeti: Cerrahi işlemden önce cerrahi örtülerle örtün. MAS kası için, önce mandibulanın alt kenarı boyunca palpe edin. Kenardan 5 mm uzakta, oral komissürü tragusa bağlayan çizgi boyunca 7 mm'lik bir kesi yapın (kesikli çizgi, Şekil 2B'deki kesiğin yerini gösterir).
4. TA kası için, tibia kemiğinin ön kenarını bulmak için önce baldır boyunca palpe edin. Dizden başlayıp ayak bileğinde bitecek şekilde bistüri ile derinin içinden kenara doğru 2 mm arkaya doğru kesin (kesikli çizgi Şekil 2H'deki kesi yerini gösterir). Her fare için, sol taraftaki MAS ve TA kası yaralanırsa, karşı taraftaki diğer kası kontrol olarak kullanın.
   NOT: Bu kesi, kesi sırasında kasların zarar görmemesini sağlamak için çok yüzeyseldir. Yüzdeki kesi tragusa çok yakın olmamalıdır. Aksi takdirde, parotis bezi açığa çıkacak ve sonraki dondurma işlemi sırasında aşırı kanamaya yol açacaktır.
5. Kuru buz dondurma: MAS ve TA kaslarının uzun eksenleri boyunca önceden soğutulmuş forseps ile bir parça kuru buz tutun (sırasıyla Şekil 2C ve Şekil 2I). Kuru buzu 5 saniye boyunca doğrudan kasın yüzeyine yerleştirin. Kuru buzu çıkardıktan hemen sonra kasın sert ve soluk beyaz göründüğünü onaylayın (Şekil 2D ve Şekil 2J), ancak bitişik yaralanmamış kasa benzer şekilde 22-25 saniye içinde normal rengine ve dokusuna döndüğünü onaylayın (Şekil 2E ve Şekil 2K).
   NOT: Kuru buzu tutan forsepsler, kuru buzun hızlı süblimleşmesini önlemek için önceden soğutulmalıdır. 5 sn donma yaralanmasının gerçekleştirilmesinde ve kasın 22-25 sn iyileşme süresinin sayılmasında bir zamanlayıcı zorunludur. İyileşme süresi 22 saniyeden kısa veya 25 saniyeden uzun olan herhangi bir kas terk edilmelidir. Bu adım pratik gerektirir.
6. Yara kapatma: Kasın tamamen iyileşmesinden sonra, cilt yarasını en az üç 7-0 dikişle kapatın (Şekil 2F ve Şekil 2L).
7. Resüsitasyon: Sütür tamamlandığında, fareleri termal destekle kafese yerleştirin ve tüm doğrultma refleksleri yeniden kazanılana kadar sürekli olarak izleyin.

2. Kas toplama

1. Fareleri aşırı dozda izofluran ile ötenazi yapın, ardından servikal çıkık yapın. Histolojik analiz için her iki taraftaki MAS ve TA kaslarını hasat edin.
2. MAS kas diseksiyonu: Farenin yüzündeki cildi kesin ve MAS kasının arka kısmını ortaya çıkarmak için parotis bezini çıkarın. MAS'ı anterior ekinden mandibula üzerindeki posterior ekine kadar diseksiyon yapın. Beyaz noktalı alan, MAS'ın açıkta kalan kısmını gösterir (Şekil 3A).
   NOT: MAS kası, her ikisi de mandibula yüzeyine yakından bağlı derin ve yüzeysel bölmelerden oluşur. MAS'ın tam izolasyonunu sağlamak için diseksiyon sırasında makası mandibulaya bastırdığınızdan emin olun. Elmacık kemiğini MAS'tan elmacık kemiği ile mandibula arasındaki sınırlarla ayırt etmeye dikkat edin.
3. TA kas diseksiyonu: Ayak bileğinden dizine kadar cildi kesin ve TA kasını ortaya çıkarmak için fasyayı çıkarın. TA'nın tendonunu izole etmek için mikro diseksiyon forsepslerinin ucunu kullanın ve tibiaya yapışan lifleri koparmak için dize kadar kaydırın. Daha sonra ayak bileğindeki tendonu kesin (Şekil 3B).
   NOT: TA kası için, fare bileğinin etrafında birkaç kas tendonu vardır; Tibiaya en büyük ve en yakın olan TA'nın tendonunu ayırt etmek pratik gerektirecektir.
4. Ön soğutma izopentan: İki yalıtım varili hazırlayın; Küçük namluyu izopentan ve büyük namluyu sıvı nitrojen ile doldurun. Kas diseksiyonundan 10 dakika önce küçük namluyu büyük namlunun içine yerleştirin (Şekil 3D).
5. Gömme kalıp hazırlığı: Her numune için silindirik bir kalay folyo kalıbı yapın ve bunları optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği ile doldurun.
6. Taze dondurulmuş: Kası, OCT bileşiğine dik tutarak OCT'ye batırın (Şekil 3C). Kalıbı önceden soğutulmuş izopentanın içine aktarmak için bir iğne tutucu kullanın. OCT'nin beyaz ve katı hale gelmesi için 40 saniye bekleyin (Şekil 3D).
   NOT: Kalıbın konumunun çok düşük olmadığından emin olun. Aksi takdirde, izopentan OCT ile karışacak ve kas dondurma sürecini bozacaktır. Kalıptaki OCT seviyesi, kas örneğinin yüksekliği ile karşılaştırılabilir olmalıdır. Hızlı ve verimli dondurma sağlamak için aşırı miktarda OCT'den kaçının.
7. Numune saklama: Taze donmuş kas numunelerini açıkça etiketlenmiş 24 oyuklu plakalarda saklayın. Numuneleri hemen bölümlere ayırın veya uzun süreli kullanım için -80 °C'de saklayın.

3. Histolojik analiz

1. Kas örneğinden 10 μm kalınlığındaki bölümleri yüzey işlem görmüş slaytlara kesmek için bir kriyostat kullanın.
2. Slaytları 20 dakika buz gibi asetona koyun ve çeker ocakta 20 dakika havayla kurutun.
3. Slaytları fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile 3 x 5 dakika yıkayın.
   NOT: Bu adımdan itibaren, kurumayı önlemek için slaytlar bir nem odasında tutulmuştur.
4. Sirius Kırmızısı boyama
   1. 0.5 g Sirius Red tozunu 500 mL doymuş pikrik asit içinde çözerek Sirius Red çalışma solüsyonunu hazırlayın.
   2. Slaytları oda sıcaklığında 1 saat boyunca Sirius Red çalışma solüsyonu ile boyayın.
   3. Slaytları 2 x 5 dakika boyunca% 0,5 asetik asit ile yıkayın.
   4. Boyama işleminden sonra, numuneler önce 15 saniye boyunca% 95 etanol içinde kurutulmalı, ardından 1 dakika boyunca susuz etanol içinde dehidrasyon yapılmalıdır. Son adım, sürgünün nötr balsam ile monte edilmesini içerir.
5. İmmünohistolojik boyama
   1. Bölümleri PBS'de% 0.3 Triton ile oda sıcaklığında 20 dakika boyunca geçirgen hale getirin, ardından bir PBS yıkaması yapın.
   2. Pax7 boyama için, referans verilen kit ile birlikte verilen reaktifle bölümleri bloke edin; laminin ve Pdgfrα boyama için, oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS'de% 5 sığır serum albümini (BSA) ve% 5 eşek serumu ile bloklayın.
   3. Bölümleri Pax7, laminin ve Pdgfrα'ya karşı birincil antikorlarla gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin, ardından 3 x 5 dakika boyunca PBS ile yıkayın.
   4. Bölümleri floresan boya konjuge ikincil antikorlarla oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin, ardından 3 x 5 dakika PBS ile yıkayın.
   5. Oda sıcaklığında 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile 3 dakika inkübe edin, ardından 3 x 5 dakika PBS ile yıkayın.
   6. Montaj ortamını bölüme yerleştirin, lamel üstüne yerleştirin ve lamel kapatmak için oje kullanın.

HE ve Sirius Kırmızı boyaması (Şekil 4 ve Ek Şekil S1), bu donma-yaralanma modelinde TA'nın tam kas rejenerasyonunu ortaya çıkardı. Buna karşılık, MAS bozulmuş miyofiber rejenerasyonu ve aşırı ekstraselüler matriks birikimi sergiledi. İntakt MAS ve TA kasının histolojisi, miyoliflerin hizalandığı ve fibrotik alanın sadece interstisyel boşlukta ve farklı demetler arasında ortaya çıktığı Şekil 4A,B'de gösterilmiştir. TA kası, yaralanmadan 14 gün sonra sağlam kontrolü ile büyük ölçüde aynı kas yapısını korurken (Şekil 4G-J), MAS kasının yapısı ciddi şekilde bozulmuştur (Şekil 4C-F). MAS kasının ön, orta ve arka kesitlerinde hemen hemen tüm kas liflerinin bulunduğu yerde fibrotik alanlar ortaya çıktı (Şekil 4C-F).

Pax7 (Ek Şekil S2) ve Pdgfrα'nın immünohistolojik boyanması, sırasıyla kas uydu hücreleri (MuSC'ler) ve fibro-adipojenik progenitörler (FAP'ler) hakkında daha fazla araştırmayı kolaylaştırdı. MAS kasında, 14 dpi'de, yoğun nüfuslu çekirdekler ortaya çıktı, ancak orantılı olarak artmış MuSC'ler yoktu (Şekil 5A, B). TA'da 14 dpi'de çok sayıda merkezi çekirdekli miyofiber (mavi ok ucu ile gösterilmiştir) tespit edilirken (Şekil 5H), miyoliflerin konturu yaralı alanda MAS'ta zar zor fark edildi (Şekil 5E,F). Bunun yerine, Pdgfrα-pozitif FAP'ların ve yeni oluşan küçük çaplı miyoliflerin (beyaz oklarla işaretlenmiş) infiltrasyonu gözlendi (Şekil 5F).

Şekil 1: Cerrahi düzeneğe genel bakış. (A) Fare uyuşturuldu ve ameliyat masasına sabitlendi. Sol tarafta yüz ve bacaktan kıllar alındı. Kas donma ve iyileşme süresini izlemek için bir zamanlayıcı kullanıldı. (B) 3,5 mm çapında ve 6-12 mm yüksekliğinde kuru buz, dondurmak için bir cam beherde hazırlandı. Forsepsler daha sonra kullanılmak üzere kuru buzda önceden soğutuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: MAS ve TA donma yaralanmasının intraoperatif kaydı. (A) MAS dondurma için epilasyon. (B) MAS kasını ortaya çıkarmak için cildi açın. (C) MAS'ın uzun ekseni boyunca kuru buz ile dondurma. (D) 5 saniye donduktan hemen sonra MAS'ın ortaya çıkması. (E) 22-25 saniye sonra MAS'ın ortaya çıkması. (F) Yüz yarasının kapanması. (G) TA dondurma için epilasyon. (H) TA kasını ortaya çıkarmak için cildi açın. (I) TA'nın uzun ekseni boyunca kuru buz kullanarak dondurma. (J) 5 saniye donduktan hemen sonra TA'nın ortaya çıkması. (K) İyileşmeden 22-25 saniye sonra TA'nın ortaya çıkması. (L) Bacak yarasının kapanması. Kısaltmalar: MAS = masseter; TA = tibialis anterior. Şekil 2B ve 2H'deki kesikli çizgiler kesilerin yerini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: MAS ve TA kas hasadı. (A) Donma yaralanmasından 14 gün sonra MAS kasının görünümü. Kırmızı kesikli oval MAS'ı gösterir; beyaz kesikli üçgen MAS kasının maruz kaldığını gösterir. (B) Donma yaralanmasından 14 gün sonra TA kasının ortaya çıkması. Kırmızı kesikli oval TA'yı gösterir. (C) Kas örneğini OCT bileşiğine dik bir şekilde batırın. (D) Kas örneğini nitrojenle soğutulmuş izopentanın içine aktarın. Kısaltmalar: MAS = masseter; TA = tibialis anterior; OCT = optimum kesme sıcaklığı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: MAS ve TA kaslarının histolojik analizi. MAS'ın sağlam (AE) sağlam kas bölümünün ve MAS'ın ön, orta ve arka bölümlerinin 14 dpi'de Sirius kırmızı boyanması. (F-J) TA'nın sağlam kas bölümü ve TA'nın ön, orta ve arka bölümü 14 dpi'de. Ölçek çubuğu = 100 μm. Kısaltmalar: MAS = masseter; TA = tibialis anterior; DPI = yaralanma sonrası gün sayısı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: MAS ve TA kaslarının immünofloresan analizi. (A) bozulmamış MAS, (B) 14 dpi MAS, (C) sağlam TA ve (D) 14 dpi TA'da Pax7 ve DAPI'nin (mavi) immün boyanması. (E) bozulmamış MAS, (F) 14 dpi MAS, (G) sağlam TA ve (H) 14 dpi TA'da laminin, Pax7 ve DAPI'nin (mavi) immün boyanması. Ölçek çubuğu = 20 μm. Kısaltmalar: MAS = masseter; TA = tibialis anterior; DPI = yaralanma sonrası günler; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Beyaz oklar, MAS'ın temsili küçük çaplı lifini gösterir. Mavi noktalı alan ve oklar, TA'nın temsili yenilenen miyoliflerini ve merkezi çekirdeklerini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: Kas rejenerasyonu sırasında kalıcı fibroz. (A) Donma yaralanmasının neden olduğu TA ve MAS kas rejenerasyonunun şematik gösterimi. (B-G) Yaralanma sonrası farklı zaman noktalarında TA ve MAS kas kesitlerinde hematoksilen ve eozin boyamasının temsili görüntüleri. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakam Cheng ve ark.8'den alınmıştır. Kısaltmalar: MAS = masseter; TA = tibialis anterior; DPI = yaralanma sonrası gün sayısı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S2: Miyogenez sürecinin bozulması. (A) TA ve MAS kasında Pax7 (yeşil) ve DAPI'nin (mavi) immünofloresan görüntüleri. (B) Pax7 pozitif/DAPI çekirdek yüzdesinin ölçülmesi. Tartı çubuğu = 100 μm * Sağlam kas kontrolünden önemli ölçüde farklı olduğunu gösterir. # Aynı zaman noktasında diğer kastan önemli ölçüde farklı olduğunu gösterir. **p < 0.01, ##p < 0.01. Bu rakam Cheng ve ark.8'den alınmıştır. Kısaltmalar: MAS = masseter; TA = tibialis anterior; DPI = yaralanma sonrası günler; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.