RESEARCH
Peer reviewed scientific video journal
Video encyclopedia of advanced research methods
Visualizing science through experiment videos
EDUCATION
Video textbooks for undergraduate courses
Visual demonstrations of key scientific experiments
BUSINESS
Video textbooks for business education
OTHERS
Interactive video based quizzes for formative assessments
Products
RESEARCH
JoVE Journal
Peer reviewed scientific video journal
JoVE Encyclopedia of Experiments
Video encyclopedia of advanced research methods
EDUCATION
JoVE Core
Video textbooks for undergraduates
JoVE Science Education
Visual demonstrations of key scientific experiments
JoVE Lab Manual
Videos of experiments for undergraduate lab courses
BUSINESS
JoVE Business
Video textbooks for business education
Solutions
Language
tr_TR
Menu
Menu
Menu
Menu
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Erratum Notice
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Retraction Notice
The article Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology. View Retraction Notice
Burada, kapalı başlı hafif travmatik beyin hasarı (mTBI) sıçan modelini ve akut ve subakut evrelerdeki davranışsal belirtiler açısından insan mTBI'sına dikkate değer benzerlik gösteren doğrulamasını sunuyoruz.
Hayvan modelleri, hafif travmatik beyin hasarı (mTBI) anlayışımızı ilerletmek ve klinik araştırmalara rehberlik etmek için çok önemlidir. Anlamlı içgörüler elde etmek için istikrarlı ve tekrarlanabilir bir hayvan modeli geliştirmek çok önemlidir. Bu çalışmada, modelleme etkisini doğrulamak için kapalı başlı bir mTBI modelinin ayrıntılı bir tanımını ve Sprague-Dawley sıçanlarını kullanan temsili bir doğrulama yöntemini sunuyoruz. Model, 550 g'lık bir kütle ağırlığını 100 cm yükseklikten doğrudan tahrip edilebilir bir yüzey üzerinde bir sıçanın kafasına düşürmeyi ve ardından 180 derecelik bir dönüşü içerir. Yaralanmayı değerlendirmek için sıçanlar, yaralanmadan 10 dakika sonra, bilinç kaybı zamanı, ilk arama davranışı süresi, kaçış yeteneği ve ışın dengesi yetenek testi dahil olmak üzere bir dizi nörodavranışsal değerlendirmeye tabi tutuldu. Yaralanmayı takip eden akut ve subakut aşamalarda, motor koordinasyon yeteneğini (Işın görevi), anksiyeteyi (Açık Alan testi) ve öğrenme ve hafıza yeteneklerini (Morris Su Labirenti testi) değerlendirmek için davranış testleri yapıldı. Kapalı kafa mTBI modeli, minimum mortalite ve çoğaltılmış gerçek yaşam durumları ile tutarlı bir yaralanma yanıtı üretti. Doğrulama yöntemi, model geliştirmeyi etkili bir şekilde doğruladı ve modelin kararlılığını ve tutarlılığını sağladı.
Hafif travmatik beyin hasarı (mTBI) veya beyin sarsıntısı, en yaygın yaralanma türüdür ve çeşitli kısa süreli ve kronik semptomlara yol açabilir1. Bu semptomlar, diğerlerinin yanı sıra baş dönmesi, baş ağrısı, depresyon ve anhedoniyi içerebilir ve mTBI2'den etkilenen bireyler için önemli acılara yol açabilir. Çoğu mTBI'ye künt kuvvet travması3 neden olduğundan, bu tür yaralanmaları doğru bir şekilde taklit eden hayvan modelleri geliştirmek zorunlu hale gelir. Bu modeller, yaralanmayı ve altında yatan mekanizmaları daha iyi anlamak için gereklidir ve insan çalışmalarına kıyasla daha az değişkenlik ve heterojenlik ile kontrollü bir ortam sunar.
Travmatik beyin hasarı (TBI) için sıvı perküsyon yaralanması (FPI)4, kontrollü kortikal etki (CCI)5, ağırlık düşürme yaralanması6, patlama travmatik beyin hasarı7 ve diğerleri dahil olmak üzere çok sayıda köklü kemirgen modeli geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu modeller öncelikle orta ila şiddetli TBI senaryolarını çoğaltmaya odaklanmaktadır. Buna karşılık, mTBI'yi simüle etmek için özel olarak tasarlanmış deneysel modeller nispeten daha az ilgi gördü ve yeterince keşfedilmedi8. Bu nedenle, mTBI'yi doğru bir şekilde temsil eden istikrarlı ve tekrarlanabilir bir hayvan modeli oluşturmak için kritik bir ihtiyaç vardır. Böyle bir model, mTBI ile ilişkili nörobiyolojik ve davranışsal sonuçlar hakkındaki anlayışımızı önemli ölçüde artıracaktır.
Anestezinin etkileri geçtikten sonra mTBI sıçanlarında fonksiyonel eksiklikler normal sıçanlara göre rastgele gözlem yoluyla ayırt edilemez. Bu nedenle, spesifik testlerin uygulanması gereklidir. İnsanlarda, hastaları değerlendirmek için çok çeşitli klinik değerlendirmeler kullanılır 9,10,11. Benzer şekilde, sıçan modelinde başarılı bir model oluşturmak, geçerliliğini belirlemek için hızlı değerlendirme araçlarının kullanılmasını da gerektirir.
Bu çalışmada, mTBH'nin insan durumuna çok benzer bir şekilde araştırılmasını sağlayan kapalı başlı bir mTBI sıçan modeli sunuyoruz. Modelin ayrıntılı açıklaması ve doğrulama prosedürü, mTBI çalışmasında kullanılan deneysel yaklaşımın kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlar.
Hayvan deneyleri, Central South Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Tüm çalışmalar laboratuvar hayvanlarının refahı ve etik ilkeleri doğrultusunda yürütülmüştür.
1. Hayvan besleme ve anestezi prosedürü
2. Ameliyat öncesi kurulum
3. mTBI indüksiyonu
4. Sahte indüksiyon
5. Doğrulama prosedürü: Akut nörodavranışsal değerlendirmeler
NOT: Aşağıdaki değerlendirmeler Nörolojik Şiddet Skorları9 ve Flierl ve ark.10 protokolüne göre değiştirilmiştir. Tüm bu değerlendirmeler, sıçan düzeltme refleksini geri kazandıktan 10 dakika sonra yapıldı.
6. Doğrulama prosedürü: Nörodavranış değerlendirmesi
NOT: Davranışsal deneylerden önce, sıçanlar, stresi ve yenilik bozulmasını en aza indirmek için art arda 3 gün boyunca günde 2 dakika boyunca ele alındı. Tüm davranışsal deneyler, deney başlamadan önce hayvanlar 60 dakika boyunca test ortamına yerleştirilerek gerçekleştirilmiştir.
Bu çalışmada kullanılan aparat, Kane modelinin ve Richelle Mychasiuk'un pediatrik modelinin değiştirilmiş bir versiyonuydu11,12. Bu çalışmada, SD sıçanlar sahte ve mTBI gruplarına ayrıldı. Bu modelin tekrarlanabilirliğini göstermek için, her deneyde 8-12 sıçan içeren akut nörodavranışsal değerlendirme ile birlikte bu modelin üç bağımsız kopyasını gerçekleştirdik. Bu çalışmada 30'dan fazla mTBI sıçan kullandık ve 2 sıçan anesteziye bağlı mortalite yaşadı. Bununla birlikte, deney sırasında hiçbir sıçan beyin hasarına yenik düşmedi. Bu deneylerin sonuçları Şekil 2'de sunulmuştur. Ek olarak, akut ve subakut evrelerde nörodavranışsal değerlendirmeler yapıldı (Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5).
Akut nörodavranışsal değerlendirme sonuçları
Tüm bu değerlendirmeler sırasıyla anestezi/darbe 0 dk (bilinç kaybı zamanı ve ilk arama davranışı zamanı) veya 10 dk (daireden çıkış ve ışın dengesi) sonra yapıldı.
Şekil 2A'da gösterildiği gibi, mTBI sıçanları bilinç kaybından kurtulmak için önemli ölçüde daha fazla zaman harcadılar, bu da önceki çalışmalarda elde edilen sonuçlarla uyumludur12,13. Normal bir fizyolojik aktivite olarak kabul edilen sıçanlarda arama davranışı, mTBI grubu içinde iyileşme süresinde istatistiksel olarak anlamlı bir artış sergilemiştir (Şekil 2B). Bu bulgu, mTBI sıçanlarının hareket, koku alma, dokunsal sondalama ve çevresel tarama yeteneklerini yeniden kazanmak için daha uzun bir süreye ihtiyaç duyduğunu göstermektedir.
Çember mevcut testi, daha önce sınav görevlilerinin yerleştirme ve propriyoseptif testler gibi öznel gözlemlerine dayanan nörolojik şiddet puanındaki orijinal duyusal testlerin yerini almıştır. mTBI sıçanları, sahte sıçanlara kıyasla çemberden çıkmak için önemli ölçüde daha uzun zaman harcadılar (Şekil 2C). Çember çıkış süresi için iki yönlü bir ANOVA kullanılarak yapılan istatistiksel analiz, yaralanmanın önemli bir ana etkisini gösterdi (F [1, 36] = 21.29, p < 0.0001), bu da mTBI ve sahte gruplar arasında bir fark olduğunu gösteriyor. Bununla birlikte, farklı çalışmaların anlamlı bir etkisi yoktu (F [2, 36] = 0.1396, p = 0.87).
Işın dengesi testinin sonuçları iki yönlü bir ANOVA kullanılarak analiz edildi, ardından Bonferroni'nin grup ortalamaları arasındaki farklar için çoklu karşılaştırmaları yapıldı (Şekil 2D). Tüm geniş ışın görevlerinde yaralanmanın önemli bir genel etkisi vardı (3 cm: F = 13.89, p < 0.001; 2 cm: F = 42.7, p < 0.001; 1.5 cm: F = 27.25, p < 0.001), mTBI sıçanlarının darbeden 10 dakika sonra sahte sıçanlara kıyasla denge bozukluğu sergilediğini gösterir. Tekrarlanan üç bağımsız deneye göre, 2 cm ve 1.5 cm genişliğindeki denge kirişi, sahte ve mTBI grupları arasında 3 cm genişliğindeki kirişe göre daha iyi ayrım gösterdi.
Nörodavranış değerlendirme sonuçları
Motor koordinasyon yeteneği, anestezi öncesi/yaralanma öncesi 1 gün ve anestezi/yaralanma sonrası 1 gün, 3 gün ve 7 gün sonra ışın görevi kullanılarak değerlendirildi (Şekil 3). Arka bacak kaymalarının toplam sayısı (Şekil 3A), tekrarlanan ölçülen iki yönlü ANOVA ile analiz edildi ve Bonferroni'nin çoklu karşılaştırmaları, mTBI sıçanlarının, sahte sıçanlara kıyasla yaralanma sonrası 1. günde önemli ölçüde daha fazla arka bacak kayması gösterdiğini buldu (Şekil 3A; p < 0.01). Bununla birlikte, 2 günlük bir iyileşmeden sonra, arka hatalarda herhangi bir değişiklik görülmedi ve toplam kayma sayısı 7 gün sonra sahte seviyelere geri döndü. Özellikle, 6 mTBI sıçanının tümünde, temel performanslarından daha fazla darbe sonrası arka bacak kayması vardı. Sahte sıçanlarda hafifçe artan arka bacak kaymaları, pratik denge kirişi eksikliği ile ilişkili olabilir. Yaralanma sonrası 1 gün ve 3 günde, mTBI sıçanları 150 cm'lik kirişi geçmek için daha fazla zaman harcadılar (39.8 s ± 3.79 s vs. 28.68 s ± 0.82 s, 37.06 s ± 4.06 s vs. 29.28 s ± 3.42 s), ancak mTBI sıçanları ve sahte sıçanlar arasında ışını tüm zaman noktalarında geçmek için geçen sürede hiçbir fark yoktu (Şekil 3B).
Sahte ve mTBI grupları arasında kat edilen mesafede anlamlı bir fark yoktu (Şekil 4A). Anksiyete benzeri davranışlar, açık alan testi sırasında merkez bölgede geçirilen süre ölçülerek değerlendirildi. Yaralanmadan sonraki hem 3 gün hem de 7 gün sonra, mTBI sıçanları, sahte sıçanlara kıyasla merkez bölgede geçirilen sürede önemli bir azalma sergiledi. Bu bulgu, mTBI sıçanlarının 7 gün içinde etkiyi takiben daha yüksek düzeyde anksiyete benzeri davranışlar sergilediğini göstermektedir (Şekil 4B, C).
Morris su labirenti öğrenme günleri sonuçları, mTBI sıçanlarının gizli platformu bulmak için sahte sıçanlardan daha fazla zamana ihtiyaç duyduğunu ortaya koydu, bu da mTBI grubunda uzamsal öğrenme ve hafızanın bozulduğunu gösteriyor (Şekil 5). Daha sonra, prob denemesi sırasında, mTBI sıçanları, kaldırılan platformu aramak için daha az zaman harcayarak kanıtlandığı gibi, uzamsal hafızayı korumada eksiklikler sergiledi. Özellikle, sahte ve mTBI grupları arasında yüzme hızında anlamlı bir fark gözlenmedi ve bu da açık alan testinde yapılan kat edilen mesafe analizinde gözlemlenen tutarlı bulguları destekledi. Bu sonuçlar, etkinin spontan lokomotor fonksiyon üzerinde fark edilebilir bir etkisi olmadığını göstermektedir.

Şekil 1: Sıçanlarda mTBI için darbe aparatı. (A) Sıçan kafasının göreceli pozisyonunda yastığın ve kaskın üstten görünümü ve yandan görünümü. Kırmızı noktalı çizgi kaskın konumunu gösterir. (B) Sıçan aşamasının ve toplama süngerinin üzerine yerleştirilmiş düşen ağırlık için dikey bir kılavuz boruyu gösteren tüm düzeneğin bir görüntüsü. (C) Kafa çarpmasını takiben sıçanın 180° dönüşünü ve ardından hızlanmayı/dönmeyi gösteren bir darbe videosundan alınan bir hareket. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Sahte mTBI sıçanlarını takiben akut nörodavranışsal değerlendirme sonuçları, bağımsız olarak üç kez tekrarlandı. (A) Sıçanlarda anestezinin kesilmesinden sonra bilinç kaybının önemli ölçüde artması, sahte sıçanlara karşı bir mTBI aldı. Anlamlı bir grup (P < 0.0001, iki yönlü ANOVA) etkisi vardı, ancak anlamlı zaman (P = 0.6226) etkisi veya grup x zamanı (P = 0.5803) etkileşimi yoktu. (B) mTBI sıçanları anesteziden sonra ilk arama davranışlarını gösterdiler. (C) Sahte sıçanlar 60 cm'lik daireden kaçmak için daha az zaman harcadılar (*p < 0.01, **p < 0.001, eşleştirilmemiş t-testi). (D) 3 cm, 2 cm ve 1.5 cm genişliğindeki kiriş dengesi puanındaki performans. Bonferroni'nin her grup için yaptığı çoklu karşılaştırmaların sonuçları şekillerde gösterilmiştir. Veriler, ortalamanın standart hatası ± ortalama olarak sunulur. Deney başına N = 8-12 sıçan kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: 1. gün, 3. gün ve 7. gündeki çarpmadan önceki ve sonraki darbeden sonraki ışın görevi performansı. (A) mTBI sıçanları, yaralanma sonrası 1. günde daha fazla arka bacak kayması yaptı (*p < 0.001, tekrarlanan ölçülen 2 yönlü ANOVA). (B) Sahte sıçanların ortalama geçiş süresi, mTBI sıçanlarınınkinden daha azdır. Veriler, ortalamanın standart hatası ± ortalama olarak sunulmuştur (N = 6/grup). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Yaralanma öncesi 1. gün ve yaralanma sonrası 1. gün, 3. gün, 7. gün ve 14. günde açık alan testinin performansı. (A) Sahte ve mTBI sıçanları arasında kat edilen mesafede bir fark yoktu. (B) mTBI sıçanları, 3. ve 7. günlerde sahte sıçanlara göre merkezde daha az zaman geçirdiler (* p < 0.01, ** p < 0.001, tekrarlanan ölçülen 2 yönlü ANOVA), yaralanma öncesi 1. günde ve yaralanma sonrası 1. günde ve 14. günde belirgin bir fark yoktu. (C) mTBI sonrası 1. gün, 3. gün, 7. gün ve 14. günde mTBI sıçanlarının haritasını takip edin. Veriler, ortalamanın standart hatası ± ortalama olarak sunulmuştur (N = 6-10/grup). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Morris su labirentindeki performans. (A) Sahte ve mTBI sıçanlar arasında yüzme yetenek testinde hız açısından fark yoktu. (B) Deneme gününde referans bellek görevinin gizli platformunda gecikme. (C) Sıçanlar, 5 deneme gününden sonra 2 dakikalık prob testi denemesinde platformu daha fazla kez geçti. Sham (5.14 ± 0.65) ve mTBI (3.56 ± 0.6), (*p < 0.01, Eşleştirilmemiş t-testi). Veriler, ortalamanın standart hatası ± ortalama olarak sunulmuştur (N = 9/grup). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Yazarların ifşa edecek herhangi bir mali çıkarı yoktur.
Burada, kapalı başlı hafif travmatik beyin hasarı (mTBI) sıçan modelini ve akut ve subakut evrelerdeki davranışsal belirtiler açısından insan mTBI'sına dikkate değer benzerlik gösteren doğrulamasını sunuyoruz.
Central South Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Bölümü'ndeki tüm bursiyerlere teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81971791) tarafından desteklenmiştir; Şangay Adli Tıp Anahtar Laboratuvarı, Adli Bilimler Anahtar Laboratuvarı, Adalet Bakanlığı, Çin (Adli Bilimler Akademisi) (No. KF202104).
| Akrilik kutu | Kurum İçi | N/A | 15 cm x 22 cm x 43 cm |
| Anestezi Makinesi | RWD Life Science Co. | R540 Fareler ve Sıçan Hayvan Anestezi Makinesi | |
| Kaskı | Şirket İçi | N / A | 10 mm çapında ve 3 mm kalınlığında paslanmaz çelik disk |
| Morris su labirenti | RWD Life Science Co. | Çap 150 cm, yükseklik 50 cm, platform çapı 35 cm | |
| Açık alan | RWD Life Science Co. | 63007 | Genişlik 100 cm, yükseklik 40 cm |
| Panlab SMART V3.0 | RWD Life Science Co. | SMART v3.0 | |
| Delikli ağırlık | Şirket içi | N/A | 550 g ağırlık ve 18 mm çap |
| Yastık | Şirket içi | N/A | Farenin başının altına yerleştirmek için kama şeklinde sünger |