İnmenin Geçici Orta Serebral Arter Oklüzyon Modeli

Dünya Sağlık Örgütü'ne göre inme, dünya çapında yılda yaklaşık 15 milyon insanı etkileyen yıkıcı bir hastalıktır. Hastaların yaklaşık üçte biri bu duruma yenik düşerken, üçte biri kalıcı sakatlık yaşar. İnme, nöral ve periferik immün hücreler, damar sistemi ve sistemik yanıtlar gibi çeşitli hücre tiplerini içeren karmaşık bir patolojidir¹. Sistem düzeyinde inme ile tetiklenen karmaşık reaksiyon ağı, şu anda in vitro modeller kullanılarak çoğaltılamamaktadır. Bu nedenle, deneysel hayvan modelleri, hastalığın mekanizmalarını araştırmak ve yeni tedaviler geliştirmek ve test etmek için gereklidir. Şu anda, erken doku reperfüzyonu, doku tipi plazminojen aktivatörü (tPA) ile tromboliz veya endovasküler trombektomi¹ yoluyla onaylanmış tek müdahaledir.

İnme hastalarında orta serebral arter (MCA) tıkanıklıkları sık görülür. Sonuç olarak, geçici MCA oklüzyonunun (tMCAo) kemirgen modelleri başlangıçta sıçanlarda^{geliştirilmiştir 2,3,4}. Günümüzde, genetiği değiştirilmiş fareler, deneysel inme modellerinde en yaygın kullanılan hayvanlardır. Bu çalışmada, farelerde minimal invaziv bir intraluminal tMCAo modeli tanımlanmıştır. Yaklaşım, kraniektomi yapılmadan boyun seviyesindeki karotis arter yoluyla gerçekleştirilir.

Oklüzyon süresinin süresi, iskemik lezyonun yaygınlığını belirleyen kritik bir faktördür. 10 dakikalık kısa tıkanıklıklar bile belirgin bir enfarktüs olmadan seçici nöronal ölüme neden olabilirken, tipik olarak 30 ila 60 dakika süren daha uzun tıkanıklıklar bir dereceye kadar serebral enfarktüse neden olur. MCA'nın korteksi besleyen ve kollateralleri olan proksimal ve distal dallarının aksine, striatuma kan sağlayan lentikülo-striatal arterlerde teminat yoktur⁵. Sonuç olarak, striatumdaki kan akışında tMCAo'dan sonra kortekse göre daha fazla azalma olur. Bu nedenle, 30 dakika veya daha kısa oklüzyonlar genellikle striatumu etkiler, ancak korteksi etkilemezken, 45 dakikadan itibaren daha uzun oklüzyonlar genellikle striatum ve dorsolateral korteks dahil olmak üzere tüm MCA bölgesinde iskemik bir lezyon oluşturur.

Farelerin refahını sağlamak için işlemden önce analjezik uyguluyoruz ve ameliyat sırasında anestezi kullanıyoruz. Bununla birlikte, anestezi potansiyel olarak farenin fizyolojisinde yapay değişiklikler getirebilir ve bazı sonuç ölçütlerini etkileyebilir⁶. Cerrahi müdahale, deneyimli personel tarafından yapıldığında, MCAo'yu indüklemek için genellikle yaklaşık 15 dakika sürer. Daha sonra, anestezi altındaki toplam süre oklüzyon süresine bağlıdır. Anestezinin en aza indirilmesinin çok önemli olduğu deneyler için, prosedürdeki alternatif bir adım, oklüzyon döneminde anestezinin kesilmesini ve sadece MCA'yı tıkayan filamentin yerleştirilmesi ve geri çekilmesi için cerrahi adımlarla sınırlandırılmasını içerir. Bu yaklaşım anestezi süresini azaltır ve deneysel model ^7,8 üzerindeki potansiyel artefaktsal etkilerini en aza indirir. Bu nedenle, geçici fokal iskemiyi indükleme yöntemi, MCA'nın intraluminal oklüzyonu ile iki varyantla sunulur: tüm oklüzyon süresi boyunca fare uyuşturularak veya bu süre boyunca fare uyanıkken. Her iki durumda da, iskemik fareler üzerinde gerçekleştirilen müdahaleye paralel olarak sahte bir ameliyat yapılmalıdır. Ek olarak, sonuç değerlendirmesine ilişkin veriler, reperfüzyondan sonra çeşitli zaman noktalarında davranış testleri ve MRG ile ölçüldüğü şekilde sağlanır. Son olarak, deneysel prosedürü uygularken göz önünde bulundurulması gereken ana faktörler tartışılmaktadır.

Hayvan çalışmaları, Katalan ve İspanyol yasalarına (Real Decreto 53/2013) ve Avrupa Direktiflerine uygun olarak, Barselona Üniversitesi etik komitesinin (Comité Ètic d'Experimentació Animal, CEEA) ve Generalitat de Catalunya'nın yerel düzenleyici kurumlarının onayı ile yürütülmüştür. Çalışmalar ARRIVE kılavuzlarına uygun olarak raporlanmaktadır. Bu prosedür, yaş sınırı olmaksızın 8 haftalıktan başlayarak yetişkin farelerde gerçekleştirilmek üzere tasarlanmıştır. 10-12 haftalık C57BL/6 farelerde geliştirilen cerrahi prosedür örnekleri burada verilmiştir. Fare suşuna bağlı anatomik farklılıklar göz önünde bulundurulmalıdır.

1. Hayvan hazırlama

1. Cerrahi işleme başlamadan önce, gerekli tüm malzemeleri ve aletleri toplayın ve sterilize edin. Ameliyat masasını gerekli tüm cerrahi malzemelerle kurun ( Malzeme Tablosunda listelenmiştir).
2. Oksijen ve nitröz oksit (% 30 /% 70) karışımı içinde izofluran inhalasyonu kullanarak hayvanı uyuşturun.
3. Analjezi sağlamak ve herhangi bir ağrı ve rahatsızlığı hafifletmek için buprenorfini (bkz. Malzeme Tablosu) 0.05 mg / kg vücut ağırlığı dozunda deri altından uygulayın.
   NOT: Analjezi zorunludur, ancak farklı protokoller kabul edilir. MCAo'dan sonraki ilk günlerde ağrı ve rahatsızlık belirtileri de kontrol edilmelidir (bkz. adım 4). Gerektiğinde düzeltici çözümler uygular.
4. Hayvanı, derin anestezi durumuna ulaşana kadar (pençe ponksiyonunda refleks kaybı ve oküler refleks) %5 izofluran içeren bir anestezi indüksiyon kutusuna (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
5. Fareyi ameliyat masasına yerleştirin ve yüz maskesi ile verilen izofluran seviyesini% 1,5'e düşürün. İşlem sırasında göz kuruluğunu önlemek için veteriner merhemi sürün.
6. Vücut ısısını bir ısıtma yastığına bağlı bir rektal prob tarafından kontrol edilen 37 ± 0.5 °C'de tutun (Malzeme Tablosuna bakınız).
7. Boynun ventral kısmını ve başını (calvaria) elektrikli bir tıraş bıçağıyla tıraş edin. Kürk kalıntılarını dikkatlice temizleyin ve cilt bölgelerini iyot bazlı dezenfektan ve% 70 alkol ile dairesel hareketlerle üç kez dezenfekte edin.
   .

2. Lazer Doppler flowmetri (LDF) ile serebral kan akımı (CBF) değerlendirmesi

1. Makasla, başın derisinde, sagital sütür yönünde, kulaklardan gözler arasındaki alana kadar bir kesi yapın.
2. Cildi geri çekin ve kafatasının sağ tarafındaki periosteuumu çıkarın.
3. Koordinatları bulun (Bregma'dan 2,5 mm yanal) ve siyanoakrilat kullanarak Doppler tutucuyu (Malzeme Tablosuna bakınız) takın. Yapıştırıcı kuruduktan sonra Doppler probunu bağlayın ve doğru sinyal okumasını kontrol edin.

3. Geçici orta serebral arter tıkanıklığı (tMCAo)

1. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin ve tıbbi bantla ameliyat masasına sabitleyin.
2. Boyunda orta hat kesisi yapın. Karotis bölgesini ortaya çıkarmak için ekartörler kullanarak cildi ve tükürük bezlerini yanal olarak geri çekin (Malzeme Tablosuna bakınız).
3. Ortak karotis arter (CCA), ICA ve ECA'nın vasküler anatomisini ve bunlardan türetilen farklı arterleri (maksiller ve lingual, superior tiroid, oksipital ve pterygopalatin) tanımlayın (Şekil 1A).
4. Ana arterleri, ele alınabilmeleri için bitişik bağ dokusundan ayırın.
   NOT: Sinirlere, özellikle CCA'ya paralel uzanan vagus sinirine zarar vermemeye özellikle dikkat edin.
5. Maksiller/lingual çatallanmada ECA'nın etrafına 6-0 ipek sütür (Malzeme Tablosuna bakınız) sarın. Dolaşımı kalıcı olarak kesmek için bir düğümü sıkıca sabitleyin.
6. Aynı arterin etrafında, ilk düğüm ile CCA çatallanması arasında ikinci bir dikiş atın ve bu düğümü gevşek tutun.
7. CCA'nın etrafına üçüncü bir iplik yerleştirin ve kolayca çözülebilen bir kayma düğümü bağlayın.
   NOT: Bu, vasküler bir klipsle de gerçekleştirilebilir, ancak iplik daha fazla hareket ve esneklik sağlar. Bu aşamada, LDF sinyalinde CBF'de ilk azalmayı gözlemlemek mümkündür.
8. ICA'dan kan dolaşımını kesen bir vasküler klips yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın).
9. ECA'da, sıkı düğümün bulunduğu bölgeye yakın küçük bir kesi yapın.
10. Monofilamenti, kalın kaplama arteriyel lümene tamamen girene kadar yerleştirin.
11. Monofilamenti arterin içinde tutmak için ikinci düğümü sıkın ve kanın uyguladığı basıncın onu dışarı itmesini önleyin (Şekil 1B).
12. Vasküler klipsi ICA'dan çıkarın.
13. ECA'yı ilk düğümün altından kesin ve kütüğü ICA yönünde yönlendirmek için döndürün (Şekil 1C).
14. Monofilamenti, MCA'nın dallandığı noktaya kadar ICA aracılığıyla ilerletin.
    NOT: Oklüzyon, LDF okumasında ani bir kan akışı düşüşüne yansır. CBF'deki düşüş bazal değerden% 70'ten fazla olduğunda başarılı bir oklüzyon olarak kabul edilir. CBF ölçüm sistemleri mevcut değilse, tıkanma noktası, yetişkin farelerde genellikle CCA'nın çatallanmasından yaklaşık 11 mm olan ilerlemeye karşı direnç ile not edilebilir.
    1. Oklüzyon döneminde anesteziye devam edilirse fareyi monitörize edin ve 45 dakika boyunca sürekli gözlem altında tutun.
    2. Oklüzyon döneminde farenin uyanması durumunda, boyun derisini birkaç dikişle dikin. LDF probunun bağlantısını kesmeden, fareyi sıcaklık kontrollü kutuya yerleştirin ve anesteziden kurtulmayı sağlayın.
       NOT: Farenin bu dönemde başarılı oklüzyonun göstergesi olarak spontan daire çizme davranışı sergilemesi yaygındır.
    3. 40 dakika sonra, 1.4, 1.5 ve 1.7 maddelerinde belirtilen anestezi ve dezenfeksiyon prosedürlerini izleyerek fareyi tekrar uyuşturun. Ameliyat masasına geri yerleştirin ve dikişleri boyundan alın.
15. 45 dakikalık oklüzyondan sonra, monofilamenti yerinde tutan düğümü gevşetin. Filamenti yavaşça ve nazikçe çekin ve doku rekanalizasyonunun gerçekleşip gerçekleşmediğini kontrol edin.
16. Filamenti dışarı çekin ve kan kaybını önlemek için düğümü sıkın.
17. CCA düğümünü çözün. Arteriyel duvar hasarı olmadığından emin olun.
18. Ekartörleri çıkarın ve kasları, bezleri ve cildi yeniden konumlandırın. Cildi dikin (6-0) ve dezenfektan uygulayın.
19. Doppler probunu ayırın ve tutucuyu ayırın. Başın cildini dikin ve dezenfekte edin.
20. Anesteziden iyileşme döneminde, fareyi sıcaklığı korumak için ısıtıcı bulunan bir kafeste bırakın. Anesteziden tamamen iyileşene kadar sürekli gözlem altında tutun. İyileştikten sonra, fare kafesine geri dönebilir.
    NOT: Sosyal zenginleştirme ile konut şiddetle tavsiye edilir. Bununla birlikte, saldırganlığı önlemek için ameliyatlı fareleri ameliyatlı farelerle aynı kafeste herhangi bir fiziksel ayrım olmadan asla karıştırmayın.

4. Ameliyat sonrası bakım

1. Yerel yönetmeliklere göre belirlenen prosedür ve yönetmeliklere uyarak hayvanları periyodik olarak denetleyin. Ameliyattan sonra ağrıyı en aza indirmek için uygun programda analjezik tedavi sağlayın.
   NOT: Bu çalışmada, girişimin başlangıcında olduğu gibi aynı analjezik (Buprenorfin 0.05 mg / kg vücut ağırlığı) ameliyattan 6 saat ve 24 saat sonra uygulandı.
2. Denetim parametreleri bunu gösterdiğinde, kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek ötenazi gerçekleştirin.
3. Günlük olarak hayvanların ağırlığını izleyin. Ameliyattan sonraki ilk birkaç gün boyunca hayvanlara yumuşak yiyecekler verin. Ek olarak, ameliyattan hemen sonra deri altı salin (200 μL) enjeksiyonu ile ve farenin kendi kendine hidratasyon yapmadığı gözlemlenirse periyodik olarak nemlendirin. Yiyecek ve suyu hayvanın kolayca erişebileceği şekilde düzenleyin.
4. İn vivo çalışma tamamlandıktan sonra, fareleri uyuşturun, ötenazi yapın ve daha fazla histopatolojik analiz için (gerekirse) beyin dokusunu çıkarın.

tMCAo prosedürünün sonucunu değerlendirmek için farklı yaklaşımlar vardır. Burada in vivo nörogörüntüleme yöntemleri (MRI) ve davranışsal testler kullanılmaktadır.

Fareler beyinde iskemik lezyonlar geliştirir ve esas olarak striatum ve dorsolateral korteks gibi MCA ipsilateral tarafından oklüzyona sağlanan bölgeyi etkiler. Lezyonun yaygınlığını belirlemek için 2,3,5-trifeniltetrazolyum klorür (TTC) doku boyama, histolojik boyama (hematoksilen/eozin, tionin asetat) ve MRG gibi in vivo nörogörüntüleme yöntemleri dahil olmak üzere çeşitli yöntemler mevcuttur. MRG, non-invaziv doğası ve aynı dokuyu diğer çalışmalar için kullanabilmesi ve her farede lezyonun kapsamlı bir değerlendirmesini sağlaması nedeniyle burada seçilmiştir. Ek olarak, MRG, aynı hayvanlarda tekrarlanan ölçümlere izin verir, sonuçların tekrarlanabilirliğini arttırır ve genellikle bir çalışma için gereken hayvan sayısını azaltır.

MRG seanslarında izofluran ile aynı anestezi protokolü (%5 indüksiyon, %1.5 idame) kullanıldı. Lezyon hacmi değerlendirmesi için, hayvanın anestezi süresini en aza indirmek için hızlı bir T2 ağırlıklı dizi (T2w turbo RARE hızlı spin-eko)9 kullanıldı, bu da aynı farelerde farklı zamanlarda MRI alımları ile uzunlamasına çalışmalar yapıldığında önemlidir. Bu prosedür, aynı hayvanlarda zaman içinde lezyondaki değişikliklerin değerlendirilmesine izin verir ve diğerlerinin yanı sıra nöroproteksiyon çalışmaları veya ilaç etkinliğini test etmek için uygulandığında çok faydalıdır. Görüntü deneyleri 7T yatay hayvan tarayıcısında gerçekleştirildi. Anatomik dizinin teknik özellikleri (manyetik alan şiddetine bağlı olarak farklılık gösterebilir): T2_TurboRARE; 22 koronal bölüm; 0,5 mm kalınlığında; yankı süresi (TE) = 33 ms; tekrarlama süresi (TR) = 2336.39 ms. 2 ortalama. Çevirme açısı, 90°; görüş alanı (FOV) = 20 mm x 20 mm, matris boyutu 256 x 256. Şekil 2A , reperfüzyondan 40 dakika, 6 saat, 24 saat ve 48 saat sonra değerlendirilen, aynı farede lezyon evriminin MR görüntülerinin temsili bir örneğini göstermektedir. Lezyon hacminin ilerlemesinin tamamlanması saatler ila yaklaşık iki gün sürer. Lezyon hacminin ölçülmesi, zaman içindeki bu evrimi gösterir (Şekil 2B).

İskemik hakaretin neden olduğu nörolojik bozukluğu değerlendirmek için çeşitli nörolojik ölçekler tanımlanmıştır. Önceki makalelerde kapsamlı bir şekilde tanımlanmış olan nöroskor testlerini kullanmanızı öneririz. Örneğin, Orsini ve ark. (2012)10 tarafından ayrıntılı olarak bildirilen test önerilmektedir.

Esas olarak motor ve duyusal işlev bozukluğundaki farklılıkları tespit etmek için çok çeşitli davranış testleri mevcuttur. Bu amaçla kavrama kuvveti testi ve köşe testi kullanılmıştır. Kavrama gücü testi, motor fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılır. Ön ayakların gücü, bir dijital kuvvet dönüştürücüsüne bağlı bir Kavrama Gücü Ölçer ile ölçülür (bkz. Malzeme Tablosu). Fare, her iki ön ayağıyla yatay bir çubuğa tutunurken yavaşça kuyruktan geriye doğru çeker. Ön ayakların serbest bırakılmasından önceki tutuşun maksimum gücü not edilir. Hayvan başına beş deneme yapılır ve maksimum ve minimum değerler hariç tutulduktan sonra ana değer hesaplanır. Köşe testi, duyusal ve motor fonksiyonların tek taraflı anormalliklerini tespit etmek için kullanılır. Aparat, 30°'lik bir açıyla tutturulmuş iki levhalı (30 cm × 20 cm × 1 cm) bir köşeden ve sonunda küçük bir açıklıktan oluşur. Fare köşeye bakacak şekilde yarıya kadar yerleştirilir. Fare köşenin derinliklerine girdiğinde, titreşimin her iki tarafı birlikte uyarılır. Fare daha sonra açık uca bakacak şekilde geri döner. Hayvan başına toplam 10 deneme yapılır ve seçilen taraflar not edilir. Fizyolojik koşullar altında P sola ve sağa dönüşler beklenirken, doğru MCAo'ya sahip farelerde doğru tercih beklenir. Tam bir dönüş elde edildiğinde veya fare başını 90º≥ çevirdiğinde bir deneme geçerli kabul edilir. Sonuçlar, sağa (ipsilateral) dönüşlerin yüzdesi olarak gösterilir.

Kavrama kuvveti testi ile ölçülen tMCAo'dan 24 saat sonra fareler tarafından sergilenen kuvvet kaybını gösteren temsili sonuçlar (Şekil 3A) ve ayrıca köşe testinde uyarıldığında lezyonun ipsilateral tarafına dönme tercihlerini gösteren temsili sonuçlar sunulmuştur (Şekil 3B). Ameliyatın aynı günü davranış testlerinin yapılması, anestezinin yakınlığı ve ameliyat sonrası dönem nedeniyle bazı parametreler değişebileceğinden daha az kesin olabilir.

Şekil 1: Boynun vasküler ağacının şematik gösterimi (sağ taraf). (A) Resimde ana arterler (Ortak Karotis Arter-CCA, Eksternal Karotis Arter-ECA, İnternal Karotis Arter-İKA) ve farklı dallar (Pterygopalatine arter Pt; Oksipital arter Occ; Superior tiroid arter St; Maksiller ve lingual arterler Max/Lin). (B) Cerrahi prosedürün ilk adımları, CCA dikişle bağlandığında, ICA dolaşımı vasküler bir klemp ile kesilir ve monofilament ECA yoluyla sokulur. (C) Monofilamenti oklüzyon bölgesine itmek için ECA'nın yeniden yönlendirilmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Temsili MR görüntüleri. (A) Reperfüzyondan sonra aynı farenin farklı zaman noktalarında T2-w görüntüleri, lezyonun akut fazdaki evrimini gösterir. Enfarktüsten etkilenen alan ilk saatlerde hızla artar ve daha sonra çok az değişiklik gösterir. (B) MCAo'dan sonra akut fazda lezyon hacminin evrimi. Her çubuk, lezyon hacminin yüzdesinin (%) ortalama ± SD'sini temsil eder. Reperfüzyondan sonraki ilk 24 saat içinde lezyon hacmi önemli ölçüde artar (*p = 0.0182; **p = 0.0088; 1 ANOVA/ Kruskal-Wallis testi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: tMCAo'dan önce (bazal) ve 24 saat sonra davranış testleri (n = 16 fare). (A) Kavrama gücü testi, fare başına maksimum (Maks.) gücü gösterir. (B) Köşe testi, sağa dönüşlerin yüzdesini (%) gösterir. Grafikler, grup başına kutu ve yatay çizgileri (minimumdan maksimum değerlere) gösterir ve noktalar tek tek farelere karşılık gelir (****p < 0.0001; Wilcoxon eşleştirilmiş çiftler işaretli sıralama testi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.