Leptomeningeal Lenfatik Endotel Hücrelerinin Hasadı ve Primer Kültürü

Yeni keşfedilen leptomeningeal lenfatik endotel hücreleri (LLEC'ler), periferik lenfatik endotel hücrelerine kıyasla farklı bir dağılım modeli sergileyerek, leptomeningler içindeki tek tek hücrelerin bir ağını oluşturur ^1,2. LLEC'lerle ilişkili hücresel fonksiyonlar ve klinik çıkarımlar büyük ölçüde keşfedilmemiş bir alan olarak kalmaktadır. LLEC'ler üzerinde fonksiyonel araştırmaların önünü açmak için, çalışmaları için bir in vitro model oluşturmak zorunludur. Bu nedenle, bu çalışma LLEC'lerin izolasyonu ve birincil kültürü için kapsamlı bir protokol geliştirmiştir.

Fareler, hastalık araştırmalarında genetik manipülasyona uygunlukları nedeniyle tercih edilen hayvan modelidir. Önceki çalışmalar, lenf düğümleri³, mezenterik doku⁴, dermal doku⁵, toplayıcı lenfatikler⁶ ve akciğer dokusu⁷ dahil olmak üzere çeşitli fare dokularından lenfatik endotel hücrelerini başarıyla izole etmiştir. Bu izolasyon prosedürleri öncelikle manyetik ile aktive edilen hücre sınıflandırması (MACS) ve akış sitometrisi sınıflandırması ^8,9,10 gibi tekniklere dayanmaktadır. Ek olarak, araştırma çabaları, sıçan araknoid hücre hatlarının ve sıçan lenfatik kılcal hücre hatlarının kurulmasına yol açmıştır^11,12. Leptomeninges¹³ için eksplant kültür tekniklerinin varlığına rağmen, LLEC'lerin izolasyonu ve kültürü için standart bir protokole acil ihtiyaç vardır. Sonuç olarak, bu çalışma, bir mikroskop rehberliğinde leptomeningleri titizlikle ayrıştırarak ve vasküler endotelyal büyüme faktörü-C (VEGF-C) kullanarak LLEC'lerin genişlemesini teşvik ederek LLEC'leri başarıyla hasat etmiş ve kültürlemiştir. Lenfatik endotel hücreleri için ayırt edici belirteç lenfatik damar hyaluronik reseptörü-1'dir (LYVE-1)¹⁴. Bu çok adımlı protokol, MACS kullanarak LYVE-1 pozitif LLEC'leri seçici olarak izole eder ve ardından akış sitometrik analizi ve immünofloresan boyama yoluyla saflıklarını doğrular.

Bu çok adımlı protokolün birincil adımları şu şekilde özetlenebilir: şişe kaplama, leptomeninglerin ayrışması, leptomeninglerin enzimatik sindirimi, hücre genişlemesi, manyetik hücre seçimi ve müteakip LLEC kültürü. Son olarak, izole edilen LLEC'lerin saflığı, akış sitometrik analizi ve immünofloresan boyama ile doğrulanır. Bu çalışmanın genel amacı, LLEC'lerin fare leptomeninglerinden izolasyonu ve sonraki in vitro kültürleri için tekrarlanabilir, çok adımlı bir protokol sunmaktır. Bu protokol, LLEC'lerin hücresel fonksiyonları ve klinik etkileri ile ilgili araştırmaları büyük ölçüde kolaylaştırmaya hazırdır.

Bu araştırma, Kunming Tıp Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu'ndan onay almıştır (kmmu20220945). Tüm deneyler belirlenmiş hayvan bakımı kurallarına bağlı kalmıştır. Leptomeningeal lenfatik endotel hücreleri (LLEC'ler), 6-8 haftalık ve 20-25 g ağırlığındaki erkek C57Bl / 6J farelerinden toplandı. Bu fareler, Çin'in Kunming kentindeki Kunming Tıp Üniversitesi'nden temin edildi. Tüm deneysel prosedür sıkı steril koşullar altında gerçekleştirildi. Tüm santrifüj adımları, aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında gerçekleştirilir.

1. Reaktiflerin ve aletlerin hazırlanması

NOT: Çözümleri içeren tüm adımlar, sınıf II biyolojik tehlike kabini içinde gerçekleştirilmelidir.

1. Fosfat tamponlu salini (PBS) kalsiyum ve magnezyum, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin (P/S) ile karıştırarak yıkama tamponunu hazırlayın (bkz. Bu tamponu 4 °C'de soğuk tutun. Kullanım gününde taze olarak hazırlanması ve tamponun gazının alınması esastır.
2. 10 mL PBS'yi (kalsiyum ve magnezyum olmadan) 2 mL% 0.25 tripsin, 1 mL 20 mg / mL papain ve 200 μL 1 mg / mL kollajenaz I ile birleştirerek sindirim enzimlerini hazırlayın (bkz.
   NOT: Tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için uygun hacimlerde alikotların kullanıldığından emin olun. Bu alikotları -20 °C'de saklayın.
3. VEGF-C (100 ng/mL) ve %1 P/S içeren, ticari olarak temin edilebilen endotel hücre büyüme ortamı kitini kullanarak kültür ortamını hazırlayın (bkz.
4. Sindirim sürecini durdurmak için Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's besiyerini (DMEM) %10 FBS ile destekleyerek durdurma tamponunu hazırlayın.
5. Steril cerrahi aletler hazırlayın: Bu aletler makas, tırtıklı uçlu cımbız ve ince uçlu cımbız içermelidir.

2. Şişe kaplaması

1. T25 şişesini 100 μg/mL fibronektin çözeltisi ile kaplayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Kullanmadan önce, bir pipet kullanarak kaplama solüsyonunu çıkarın.
2. Şişeyi PBS ile üç kez yıkayın, ardından PBS'yi aspire edin ve T25 şişesinin kurumasını bekleyin.

3. Leptomeninges ayrışması

NOT: Daima 4 °C'de önceden soğutulmuş tamponlar ve çözeltiler kullanın.

1. Fareleri% 4 izofluran soluyarak uyuşturun ve daha sonra% 70 etanol ile temizlenmiş makas kullanarak hızlı dekapitasyon ile kurban edin.
2. Kafatasının arkasındaki açıklıktan başlayarak ve ön bölgeye doğru uzanan cildi orta hat boyunca dikkatlice kesin.
3. Kafatasını nazikçe çıkarın, leptomeninglere zarar vermemek için makasla hafifçe kaldırın ve leptomeningler de dahil olmak üzere tüm beynin elde edilmesini sağlayın.
4. Tüm beyni bir yıkama tamponuna batırın ve yüzeydeki kanı çıkarmak için hafifçe yıkayın.
5. Beyni doğramadan steril bir Petri kabına aktarın ve mikroskop altında ince uçlu cımbız kullanarak leptomeningleri beyin yüzeyinden çıkarın.
6. Leptomeninges dokusunu steril mikro makas kullanarak parçalara ayırın.

4. Leptomeninges enzimatik sindirim

1. Parçalara 10 mL enzim karışımı (adım 1.2) ekleyin ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin. Parçaların tüpün altından ayrıldığından emin olmak için hafifçe çalkalayın. Daha sonra, sindirimi durdurmak için 10 mL durdurma tamponu (adım 1.4) ekleyin.
2. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve bir pipet kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın.
3. 10 mL soğuk PBS ekleyin ve herhangi bir topaklanmayı filtrelemek için karışımı 70 μm'lik bir süzgeçten 50 mL'lik steril bir tüpe geçirin.

5. Hücre genişlemesi

1. Plaka 1 x 10 cm^{başına 5 hücre2 5} mL kültür ortamı ile fibronektin kaplı bir T25 şişesine (adım 2).
2. Hücreleri 37 °C'de %5 CO₂ ile 24 saat inkübe edin. Daha sonra, bağlı olmayan hücreleri ortadan kaldırmak için ortamı çıkarın.
3. Her iki günde bir ortamın %50'sini değiştirerek kültürü sürdürün. Bu işlemi iki veya üç kez tekrarlayın.

6. Manyetik hücre seçimi

NOT: Hızlı çalışın, hücre soğukluğunu koruyun ve spesifik olmayan hücre etiketlemesini önlemek için önceden soğutulmuş solüsyonlar kullanın.

1. Aletlerin ve reaktiflerin hazırlanması: manyetik bir ayırıcı standına manyetik bir ayırıcı takın (bkz. Malzeme Tablosu). Manyetik ayırıcıya bir seçim sütunu bağlayın ve seçim sütununun üzerine 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin. Akışı toplamak için seçim sütununun altına 50 mL'lik bir tüp yerleştirin.
2. Enzimatik sindirim: Hücreler %80 birleşmeye ulaştığında, ortamı aspire edin ve hücreleri PBS ile durulayın. Yapışan hücreleri ayırmak için% 0.25 tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Durdurma tamponunu ekleyerek sindirimi durdurun. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
3. Antikor inkübasyonu: 100 μL PBS'de 1 x^{10 7} toplam hücreyi yeniden süspanse edin ve 10 μL LYVE-1 antikoru ekleyin (bkz. İyice karıştırın ve karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
   1. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün ve süpernatanı atın. 1 mL PBS ekleyerek ve 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyerek hücreleri durulayın. Süpernatanı tamamen çıkarın.
4. Mikro boncuk etiketleme: hücreleri 100 μL PBS'de yeniden süspanse edin ve 20 μL Mikro boncuk ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). İyice karıştırın ve karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
   1. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün ve süpernatanı boşaltın. Daha sonra, hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme yoluyla 1 mL PBS ile temizleyin. Son olarak, süpernatanı tamamen çıkarın.
5. Manyetik negatif dışlama: hücreleri 4 mL PBS'de yeniden süspanse edin. Kümeleri ortadan kaldırmak için hücreleri 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Seçim sütununu (Malzeme Tablosuna bakın) 3 mL PBS ile durulayarak hazırlayın, ardından hücre süspansiyonunu seçim sütununa uygulayın.
   1. 3 mL PBS ile yıkama adımlarını gerçekleştirin ve LYVE-1-negatif hücreleri, geçmelerine izin vermek için seçim sütununun altına yerleştirilmiş 50 mL'lik bir tüpe toplayın.
6. Manyetik pozitif seçim: Seçim sütununa 6 mL PBS pipetleyin. LYVE-1 pozitif LLEC'ler elde etmek için pistonu seçim sütununa sıkıca iterek manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri anında temizleyin.
   NOT: Bir sonraki adıma geçmeden önce her zaman seçim sütunu haznesinin boşalmasını bekleyin.

7. LLEC kültürü

1. LYVE-1-pozitif LLEC'leri 300 x g'de 5 dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatanı dikkatlice çıkarın.
2. Plaka 1 x 10^{cm başına 5 hücre2} 5 mL kültür ortamı ile fibronektin kaplı bir T25 şişesine.
3. Ortamın %50'sini her gün değiştirerek kültürü koruyun. Hücreler% 80 birleşmeye ulaştığında,% 0.25 tripsin ile hücreleri ayırın ve hücre geçişini gerçekleştirin. Hücreleri 2-3 geçişten sonra sonraki deneyler için kullanın.

8. Akış sitometrik analizi

NOT: Flow sitometrik analizi, daha önce açıklanan prosedür¹⁵ izlenerek gerçekleştirilmiştir.

1. Yapışan hücreleri ayırmak için% 0.25 tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Ardından, sindirimi durdurmak için durdurma tamponunu ekleyin.
2. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı tamamen aspire edin. 100 μL PBS'de 1 x^{10 6} hücreyi yeniden süspanse edin.
3. 1 μL LYVE-1 antikoru ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika inkübe edin.
4. Akış sitometrisi ve FlowJo yazılımı kullanılarak analiz için hücreleri uygun miktarda PBS tamponunda yeniden süspanse edin (bkz. Malzeme Tablosu).

9. İmmünofloresan boyama

NOT: İmmünofloresan boyama, daha önce açıklanan prosedür izlenerek gerçekleştirilmiştir¹⁶.

1. Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %4 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin. PFA'yı atın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
2. Blok tamponunu oda sıcaklığında 1 saat uygulayın. Blok tamponunu lamellerden çıkarın.
3. Boyama tamponundaki LYVE-1 antikorunu hücrelere ekleyin ve karanlıkta inkübe edin. Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
4. Boyama tamponuna uygun bir ikincil antikor ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) hücrelere ve karanlıkta inkübe edin. Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
5. 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile karşı boyama. Hücreler artık immünofloresan mikroskobu için hazırdır.

Bu çalışma, farelerden lenfatik endotel hücrelerinin (LLEC'ler) toplanması ve daha sonra birincil kültürlerinin in vitro olarak oluşturulması için tekrarlanabilir, çok aşamalı bir protokol sunmaktadır. Anahtar adımlar, şişe hazırlama ve fibronektin kaplama, leptomeninglerin ayrışması, enzimatik sindirim yoluyla tek hücreli bir süspansiyon elde edilmesi ve VEGF-C ile LLEC'lerin genişlemesinin indüklenmesini içerir. LYVE-1 pozitif LLEC'ler daha sonra manyetik olarak aktive edilen hücre sınıflandırması (MACS) kullanılarak seçici olarak izole edilir. Son olarak, LLEC'lerin saflığını değerlendirmek için immünofloresan boyama ve akış sitometrik analizi yapılır ve MTT tahlil sonuçları sağlam LLEC büyüme oranlarını gösterir (Ek Şekil 1). Bu çok prosedürlü protokolün birincil adımları, tüm süreç yaklaşık 2-3 hafta sürecek şekilde akış şemasında gösterilmektedir (Şekil 1).

LLEC'leri hasat etmek için, etkili cerrahi tekniklerle hücre canlılığını korurken ve soğuk bir ortamı korurken leptomeningleri ayırmak ve LLEC'lerin genişlemesini teşvik etmek esastır (Şekil 2A-E). Steril koşullar altında leptomeninglerle birlikte tüm beyin elde edildikten sonra, kan kırmızısı hücreleri uzaklaştırmak için hafif bir yıkama adımı gerçekleştirilir (Şekil 2F). Daha sonra, leptomeningler beyin yüzeyinden mikroskop altında dikkatlice çıkarılır (Şekil 2G). Bu leptomeningler esas olarak kollajen liflerinden oluşur, bu nedenle enzimatik sindirimi hızlandırmak için parçalanırlar (Şekil 2H). Daha sonra, bu parçaların enzimatik sindirimi gerçekleştirilir ve kalan kümeler, daha büyük kollajen lif kümelerini ortadan kaldırmak için 70 μm'lik bir süzgeçten süzülür (Şekil 2I). Son olarak, hücreler fibronektin kaplı bir T25 şişesine kaplanır ve genişlemeyi indüklemek için VEGF-C eklenir (Şekil 2J). 24 saat sonra, bağlanmamış hücreleri ortadan kaldırmak için kültür ortamı çıkarılır. Bu adımlar, hücrelerin leptomeninglerden toplanmasını kolaylaştırır ve sürecin ilerleyen aşamalarında yeterli LYVE-1-pozitif LLEC'ler elde etmek için kritik olan genişlemeyi teşvik eder.

Yazarlar, ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.