Bu protokol, alerjik rinitin sıçan modelini değerlendirmek için çok renkli bir immünofloresan tekniğini açıklar.
Allerjik rinit (AR), dünya nüfusunun yaklaşık %10-20’sini etkileyen, primer olarak spesifik immünoglobulin E (IgE) aracılık eden, burun mukozasının kronik, enfeksiyöz olmayan inflamatuar bir hastalığıdır. İmmünofloresan (IF) boyama, hastalığa özgü protein ekspresyonunu tespit etmek için uzun süredir standart bir teknik olsa da, geleneksel IF teknikleri, aynı numunedeki üç veya daha fazla proteinin ekspresyon seviyelerini tespit etme yeteneklerinde sınırlıdır. Sonuç olarak, son yıllarda, hücrelerde veya dokularda birden fazla hedefin aynı anda etiketlenmesine izin veren çok renkli IF teknikleri geliştirilmiştir.
Bu protokol, bir AR sıçan modeli oluşturma, nazal mukozal örneklerin alınması ve çok renkli immünofloresan için teknik prosedürler için kapsamlı bir genel bakış sağlar. AR grubundaki tüm sıçanlar hapşırma, burun akıntısı ve burun kaşıntısı gibi tipik semptomlar sergiledi ve davranışsal gözlemler ≥5 puan aldı. Hematoksilen ve eozin (H&E) boyama, AR grubunda artmış inflamatuar hücre sayısı ve bozulmuş nazal mukozal bütünlük ortaya çıkardı. Çok renkli immünofloresan (mIF), RORγt ve TICAM-1 ekspresyonunun arttığını gösterirken, AR sıçanlarının burun mukoza dokusunda Foxp3 ekspresyonu azaldı.
Allerjik rinit (AR), primer olarak spesifik immünoglobulin E (IgE)1,2’nin aracılık ettiği burun mukozasının kronik, enfeksiyöz olmayan inflamatuar bir hastalığıdır. Hapşırma, burun akıntısı, burun tıkanıklığı ve burun kaşıntısı gibi semptomlarla karakterizedir. Sanayileşme ve kentleşme ile birlikte, AR prevalansı giderek artmakta ve dünya nüfusunun yaklaşık %10-20’sini etkilemektedir1. İmmünofloresan (IF) tekniği, bir antikor-antijen bağlanma reaksiyonu kullanan bir floresan boyama yöntemidir. Biyolojik dokularda veya hücrelerde spesifik proteinlerin dağılımını ve ekspresyon seviyelerini tespit etmek ve ölçmek için kullanılabilir. AR araştırmasında IF, AR ile ilişkili sitokinler, inflamatuar hücreler, reseptörler ve daha fazlası dahil olmak üzere birden fazla hedefi aynı anda tespit edebilir ve AR patogenezinin ve ilaçların etkilerininaraştırılmasını kolaylaştırır 3,4,5,6.
Çok renkli immünofloresan (mIF) boyama işlemi, her boyama turu sırasında bir antikor elüsyon adımının eklenmesiyle geleneksel IF’ye çok benzer. Bu modifikasyon, sıralı tek etiketleme ve çoklu yeniden boyama turları yoluyla aynı doku kesitinde birden fazla biyobelirteçin aynı anda saptanmasını sağlar. mIF, tiramid sinyal amplifikasyonuna (TSA) dayanır ve tekrarlanan TSA floresan boyama döngülerine ve floresan sinyallerinikorurken antikorları uzaklaştırmak için mikrodalga ısıtmanın kullanılmasına izin verir 7,8. Konvansiyonel IF ile karşılaştırıldığında, mIF çeşitli avantajlar sunar: (1) konvansiyonel IF 9,10 ile tanımlanması zor olan zayıf eksprese edilmiş antijenleri tespit edebilir; (2) geliştirilmiş sinyal-gürültü oranı ile yüksek kaliteli boyama sağlar; (3) dokuya özgü yapıların ve ilgilenilen bölgelerin nicelleştirilmesine izin verir11; (4) çoklu yolakların çoğullanması, dokuları verimli bir şekilde kullanır ve sınırlı patolojik kaynakları korur12; (5) mIF aracılığıyla çok parametreli analiz, gizli biyolojik bilgileri ortaya çıkararak dokular hakkında daha derin bilgiler sunar13.
Genel olarak, mIF, aynı numune içinde farklı antijen ekspresyonlarının ve dağılımlarının gözlemlenmesine izin vererek hedef proteinlerin incelenmesini kolaylaştırır. Gelecekte, çoklu hedef proteinlerin ekspresyonunu ve dağılımını anlamak isteyen araştırmacılar bu tekniği değerli bir seçim olarak göreceklerdir. Bu çalışma, sıçanlardan alınan nazal mukoza örneklerinin AR ile boyanması için mIF’nin uygulanmasını göstermekte ve bir AR sıçan modelinin oluşturulmasını değerlendirmektedir.
Allerjik Rinit (AR), çevresel ve genetik faktörlerin bir kombinasyonundan kaynaklanan burun mukozasının enfeksiyöz olmayan inflamatuar bir hastalığıdır. İş verimliliğini etkileyen, yaşam kalitesini düşüren, uykuyu, bilişsel işlevi bozan, sinirlilik ve yorgunluğa neden olan küresel bir sağlık sorunu haline geldi. AR, dünya nüfusunun %10-20’sini¹ etkilemekte ve önemli ekonomik maliyetler taşıyarak AB ülkelerinde yıllık 30-50 milyar avroya varan kayıplara neden olmaktadır18…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Sichuan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Departmanı (2021YJ0175) tarafından desteklenmiştir.
Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
75% ethanol | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
Ammonia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
Anhydrous ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
Anti-fluorescence quenching sealer | SouthernBiotech | 0100-01 | |
Automatic dyeing machine | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
Carrier slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
Citrate-phosphate buffer | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
Citric acid antigen repair solution (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
Coverslip | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
Decoloring shaker | SCILOGEX | S1010E | |
EDTA decalcification solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
Electric heating blast dryer | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
Fast tissue dewatering machine | Thermo scientific | STP420 ES | |
Film sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
Fluorescence microscope | Sunny Optical Technology Co.Ltd | CX40 | |
Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
Freezing table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
Goat serum | Biosharp | BL210A | |
H&E staining kit | Leagene | DH0020 | |
Hemostatic forceps | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
Hydrochloric acid | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
Immunohistochemical pen | Biosharp | BC004 | |
Microwave oven | Midea | M1-L213B | |
Neutral gum | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
Ovalbumin | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
Palm centrifuge | SCILOGEX | D1008E | |
Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
Pathology section scanner | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
Pipette | Dragon | KE0003087/KA0056573 | |
Rorγt | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
Slicer | Thermo scientific | HM325 | |
Slicing machine | Thermo scientific | HM325 | |
Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
Sprague Dawley rats | Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine | SYX 2023-0100 | |
TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
Tissue scissors | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
Tissue spreading baking sheet machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
TYR-690 fluorescent dyes | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
Vortex mixer | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
Water bath-slide drier | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
Wax trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |