Çatallı A4F Mikroakışkan Cihaz ile Büyük Hacimli Örneklerden Hücre Dışı Veziküllerin Tek Adımlı İzolasyonu
Özet
Hücre dışı veziküller biyomedikal uygulamalar için büyük umut vaat etmektedir, ancak mevcut izolasyon yöntemleri zaman alıcıdır ve klinik kullanım için pratik değildir. Bu çalışmada, hücre dışı veziküllerin büyük hacimli biyoakışkanlardan minimum adımlarla sürekli bir şekilde doğrudan izolasyonunu sağlayan bir mikroakışkan cihaz sunuyoruz.
Abstract
Hücre dışı veziküller (EV’ler), teşhis, ilaç dağıtımı ve rejeneratif tıp dahil olmak üzere çeşitli biyomedikal uygulamalar için muazzam bir potansiyele sahiptir. Bununla birlikte, EV’leri izole etmeye yönelik mevcut metodolojiler, karmaşıklık, zaman tüketimi ve klinik çevirilerini engelleyen hantal ekipman ihtiyacı gibi önemli zorluklar ortaya koymaktadır. Bu sınırlamaları ele almak için, EV’lerin büyük hacimli numunelerden sürekli bir şekilde verimli bir şekilde izole edilmesi için siklik olefin kopolimer-stokiyometri dışı tiyol-ene (COC-OSTE) dayalı yenilikçi bir mikroakışkan sistem geliştirmeyi amaçladık. Boyut ve kaldırma kuvvetine dayalı ayırmayı kullanarak, bu çalışmada kullanılan teknoloji, idrar ve hücre ortamı örneklerinden elde edilen mevcut yaklaşımlara kıyasla önemli ölçüde daha dar bir boyut dağılımı elde etti ve gelecekteki uygulamalarda belirli EV boyut fraksiyonlarının hedeflenmesini sağladı. Çatallı asimetrik akış alan akış fraksiyonlama teknolojisini kullanan yenilikçi COC-OSTE mikroakışkan cihaz tasarımımız, büyük hacimli numuneler için basit ve sürekli bir EV izolasyon yaklaşımı sunar. Ayrıca, bu mikroakışkan cihazın seri üretim potansiyeli, ölçeklenebilirlik ve tutarlılık sunarak, EV izolasyonunu, yüksek tutarlılık ve verimin temel gereksinimler olduğu rutin klinik teşhis ve endüstriyel süreçlere entegre etmeyi mümkün kılar.
Introduction
Hücre dışı veziküller (EV’ler), iki ana tip içeren hücre kaynaklı zara bağlı parçacıklardır: eksozomlar (30-200 nm) ve mikro-veziküller (200-1000 nm)1. Eksozomlar, multiveziküler bir cisim (MVB) içinde endozomal membranın içe doğru tomurcuklanması yoluyla oluşur ve plazma membranı1 ile füzyon üzerine hücre dışı boşluğa intraluminal vezikülleri (ILV’ler) serbest bırakır. Buna karşılık, mikro-parçacıklar, hücre zarının2 dışa doğru tomurcuklanması ve fisyonu ile üretilir. EV’ler, proteinleri, nükleik asitleri, lipitleri ve metabolitleri taşıyarak, büyüme, anjiyogenez, metastaz, proliferasyon ve tedavi direnci dahil olmak üzere hücrenin fizyolojik durumunu yansıtarak hücreler arası iletişimde çok önemli bir rol oynar3. Sonuç olarak, kanser de dahil olmak üzere hastalıklar için umut verici biyobelirteçler ve terapötik hedefler olarak ortaya çıkmışlar ve teşhis ve ilaç dağıtım sistemlerindeki potansiyellerini vurgulamışlardır4.
Hastalık teşhisi ve tedavisinde EV’leri tam olarak kullanmak için, çeşitli biyosıvılardan verimli izolasyon çok önemlidir5. Yaygın yöntemler arasında ultrasantrifüjleme (UC), yoğunluk gradyanlı santrifüjleme, boyut dışlama kromatografisi (SEC), filtrasyon ve immünoizolasyon6 bulunur. UC yaygın olarak kullanılan bir tekniktir, ancak EV olmayan ve EV agregaları üretebilen benzer yoğunlukta parçacıklar verebilir7. SEC, yoğunluk8 yerine boyuta dayalı parçacıkları hariç tutarak daha yüksek saflıkta numuneler sağlama yeteneği nedeniyle popülerlik kazanmıştır. Bununla birlikte, SEC kolonu için uygun gözenek boyutunun dikkatli bir şekilde seçilmesi ve kromatografi koşullarının optimizasyonu, şilomikronlar ve düşük yoğunluklu lipoproteinler gibi istenmeyen partiküllerin birlikte izolasyonunu en aza indirmek için gereklidir8. Etkinliklerine rağmen, her iki yöntem de özellikle hücre ortamı veya idrar gibi daha büyük hacimli numuneler için zaman alıcı ve otomatikleştirilmesi zordur, bu da endüstriyel uygulamalar için ölçeklenebilirliklerini sınırlar9.
Son yıllarda, asimetrik alan akış alanı fraksiyonlaması (A4F), boyut ve kaldırma kuvvetine dayalı mikro ve nanometre boyutlu partikül ayırma için güçlü bir ayırma tekniği olarak gelişmiştir10. A4F’nin çalışma prensibi, tabanında gözenekli bir zar bulunan ve çapraz akış10 adı verilen zara uygulanan bir kuvvet üreten bir mikroakışkan kanala dayanır. Sisteme özgü Brown hareketi ve Poiseuille akışı ile birleştirildiğinde, çapraz akış, akış dinamikleri11 içindeki değişen parçacık konumu nedeniyle verimli parçacık ayrımını kolaylaştırır. Faydalarına rağmen, bu yöntem mikrolitre aralığındaki numune hacimleri12 ile sınırlıdır ve işlemin süresiniuzatan ek bir odaklama adımı gerektirir 10.
Son on yılda, mikroakışkanlar hızlı, verimli ve klinik olarak güvenilir EV ayrımı için bir araç olarak öne çıkmıştır13. Bununla birlikte, EV ayırma için tasarlanan çoğu mikroakışkan yöntem, küçük hacimli, yüksek konsantrasyonlu EV numuneleri için optimize edilmiştir veya karmaşık ayırma prosedürlerinebağlıdır 14. Ayrıca, mikroakışkanlar alanında, polidimetilsiloksan (PDMS), optik şeffaflığı, biyouyumluluğu ve kullanım kolaylığı nedeniyle altın standart malzeme olarak kabul edilmektedir15. Bununla birlikte, EV’ler de dahil olmak üzere küçük lipofilik molekülleri absorbe etme eğilimi, EV alanındaki uygulaması için sorunlu olabilir13.
Siklik olefin kopolimeri (COC), biyouyumluluk, moleküllerin küçük absorpsiyonu ve yüksek kimyasal direnci nedeniyle mikroakışkanlarda sıklıkla kullanılan bir malzemedir15. Bununla birlikte, COC cihazlarının imalatı genellikle karmaşık süreçleri veya özel ekipmanı içerir16. Alternatif olarak, stokiyometri dışı tiyol-en (OSTE), küçük moleküllerin emiliminin azalması, üstün kimyasal stabilite, üretim kolaylığı ve ölçeklenebilir üretim süreci nedeniyle PDMS’ye umut verici bir alternatiftir17,18. Bununla birlikte, borulara yapılan karmaşık bağlantılar nedeniyle, cihazlar sızıntıyaeğilimli olabilir 19.
Bu çalışmanın amacı, idrar veya hücre ortamı gibi büyük hacimli numunelerden EV ayrımı için OSTE ve COC ve çatallı A4F prensibini birleştiren bir mikroakışkan cihaz tasarlamak ve üretmekti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sunulan mikroakışkan cihaz, UC ve SEC12 gibi mevcut altın standart yöntemlerin bazı kritik sınırlamalarını ele alarak, EV’lerin biyolojik sıvılardan izolasyonu ve ekstraksiyonu için umut verici bir yöntem sunmaktadır. UC ve SEC’in emek yoğun, zaman alıcı olduğu ve düşük verimden muzdarip olduğu bilinmektedir, bu da onları büyük miktarlarda EV’ye ihtiyaç duyulan yüksek verimli uygulamalar için daha az uygun hale getirir21,22<sup class="…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmaya katılan tüm bağışçılara, Letonya Genom Veritabanı personeline örnekleri sağladıkları için teşekkür ederiz. Letonya Üniversitesi Katıhal Fiziği Enstitüsü, Mükemmeliyet Merkezi olarak, Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 Çerçeve Programı H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2’den 739508 No’lu hibe sözleşmesi, proje CAMART2. kapsamında fon aldı. Bu çalışma Letonya Bilim Konseyi Proje No. tarafından desteklenmiştir. lzp-2019/1-0142 ve Proje No: lzp-2022/1-0373.
Materials
| 0.1 µm carboxylate FluoSpheres | Invitrogen | #F8803 | Stock concentration: 3.6 x 1013 beads/mL (LOT dependent) |
| 0.5 mL microcentrifuge tubes | Starstedt | 72.704 | |
| 1 mL Luer cone syringe single use without needle | RAYS | TUB1ML | |
| 1.0 µm polystyrene FluoSpheres | Invitrogen | #F13083 | Stock concentration: 1 x 1010 beads/mL (LOT dependent) |
| 10 mL Serological pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| 15 mL (100k) Amicon Ultra centrifugal filters | Merck Millipore | UFC910024 | |
| 2.0 mL Protein LoBind tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| 20 mL syringes | BD PlastikPak | 10569215 | |
| 250 µm ID polyether ether ketone tubing | Darwin Microfluidics | CIL-1581 | |
| 3 kDa MWCO centrifugal filter units | Merck Millipore, | UFC200324 | |
| 5 mL Medical Syringe without Needle | Anhui Hongyu Wuzhou Medical | 159646 | |
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 70 Ti fixed angle ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| 800 µm ID polytetrafluoroethylene tubing | Darwin Microfluidics | LVF-KTU-15 | |
| 96 well microplate, f-bottom, med. binding | Greiner Bio-One | 655001 | ELISA plate |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine serum albumin | SigmaAldrich | A7906-100G | |
| COC Topas microscopy slide platform | Microfluidic Chipshop | 10000002 | |
| COC Topas microscopy slide platform 2 x 16 Mini Luer | Microfluidic Chipshop | 10000387 | |
| Elveflow OB1 pressure controller | Elvesys Group | ||
| Luer connectors | Darwin Microfluidics | CS-10000095 | |
| Mask aligner Suss MA/BA6 | SUSS MicroTec Group | ||
| Mixer Thinky ARE-250 | Thinky Corporation | ||
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | NS300 | nanoparticle analyzer |
| Optical microscope Nikon Eclipse LV150N | Nikon Metrology NV | ||
| OSTE 322 Crystal Clear | Mercene Labs | ||
| PBS TABLETS.Ca/Mg free. Fisher Bioreagents. 100 g | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| PC membrane (50 nm pore diameter, 11.8% density) | it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgium | ||
| Petri dishes, sterile | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| Plasma Asher GIGAbatch 360 M | PVA TePla America, LLC | ||
| qEVoriginal/35 nm column | Izon | SP5 | SEC column |
| QSIL 216 Silicone Elastomer Kit | PP&S | ||
| Resin Tough Black | Zortrax | ||
| SW40 Ti swing ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 331301 | |
| Syringe pump | DK Infusetek | ISPLab002 | |
| T175 suspension flask | Sarstedt | 83.3912.502 | |
| TIM4-Fc protein | Adipogen LifeSciences | AG-40B-0180B-3010 | |
| TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) | SigmaAldrich | T0440-100ML | Horseradish peroxidase substrate |
| Tween20 | SigmaAldrich | P1379-100ML | |
| Ultracentrifuge Optima L100XP | Beckman Coulter | ||
| Ultrasonic cleaning unit P 60 H | Elma Schmidbauer GmbH | ||
| Universal Microplate Spectrophotometer | Bio-Tek instruments | 71777-1 | |
| Urine collection cup, 150mL, sterile | APTACA | 2120_SG | |
| Whatman Anotop 25 Syringe Filter | SigmaAldrich | 68092002 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | dynamic light scattering (DLS) system | |
| Zortrax Inkspire | Zortrax |
Referanslar
- Colombo, M., et al. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
- Tricarico, C., et al. Biology and biogenesis of shed microvesicles. Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4 (1), 27066 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Wang, Z. Extracellular vesicles as an emerging drug delivery system for cancer treatment: Current strategies and recent advances. Biomed Pharmacother. 153, 113480 (2022).
- Royo, F., et al. Methods for separation and characterization of extracellular vesicles: Results of a Worldwide Survey Performed by the ISEV Rigor and Standardization Subcommittee. Cells. 9 (9), 1955 (2020).
- Sidhom, K., et al. A review of exosomal isolation methods: Is size exclusion chromatography the best option. Int J Mol Sci. 21 (18), 6466 (2020).
- Reshi, Q. U. A., et al. Isolation of extracellular vesicles (EVs) using benchtop size exclusion chromatography (SEC) columns. Methods Mol Biol. 2273, 201-206 (2021).
- Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. J Chromatogr A. 1636, 461773 (2021).
- Priedols, M., et al. Bifurcated asymmetric field flow fractionation of nanoparticles in PDMS-free microfluidic devices for applications in label-free extracellular vesicle separation. Polymers. 15 (4), 789 (2023).
- Zhang, H., Lyden, D. Asymmetric-flow field-flow fractionation technology for exomere and small extracellular vesicle separation and characterization. Nat Protoc. 14 (4), 1027-1053 (2019).
- Talebjedi, B., et al. Exploiting microfluidics for extracellular vesicle isolation and characterization: Potential use for standardized embryo quality assessment. Front Vet Sci. 7, 620809 (2020).
- van Meer, B. J., et al. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophys Res Commun. 482 (2), 323-328 (2017).
- Jia, Y., et al. Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications. Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).
- Bussooa, A., et al. Real-time monitoring of oxygen levels within thermoplastic Organ-on-Chip devices. Biosensors and Bioelectronics: X. 11, 100198 (2022).
- Tang, L., Lee, N. Y. A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature. Lab Chip. 10 (10), 1274-1280 (2010).
- Borda, E., et al. Conformable neural interface based on off-stoichiometry thiol-ene-epoxy thermosets. Biomaterials. 293, 121979 (2023).
- Sandström, N., et al. Reaction injection molding and direct covalent bonding of OSTE+ polymer microfluidic devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 25 (7), 075002 (2015).
- Sticker, D., et al. Thiol-ene based polymers as versatile materials for microfluidic devices for life sciences applications. ACS Appl Mater Interfaces. 12 (9), 10080-10095 (2020).
- Bajo-Santos, C., et al. Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device. Int J Mol Sci. 24 (9), 7971 (2023).
- Claridge, B., et al. Development of extracellular vesicle therapeutics: Challenges, considerations, and opportunities. Front Cell Dev Biol. 9, 734720 (2021).
- Rezaie, J., et al. Review on exosomes application in clinical trials: Perspective, questions, and challenges. Cell Commun Signal. 20 (1), 145 (2022).
- Aragón, I. M., et al. The urinary tract microbiome in health and disease. Eur Urol Focus. 4 (1), 128-138 (2018).
