Semende Peroksidaz Pozitif Lökositlerin İncelenmesi

Kısırlık, üreme çağındaki çiftlerin yaklaşık %15'ini etkileyen küresel bir halk sağlığı sorunu olarak ortaya çıkmıştır. Erkek faktörleri, toplam subfertilite vakalarının yaklaşık% 50'sinden etkilenir ve yaklaşık% 20 ila% 30'u yalnızca erkek faktörlerine atfedilebilir ^1,2,3. Erkek genital sistem enfeksiyonları (MGTI'ler), erkek infertilitesinin önemli nedenlerinden birini oluşturur ve vakaların yaklaşık %15'ini oluşturur ^4,5.

Çoğu bireyin menisinde spermatozoan olmayan hücrelerin %13'ünü oluşturan lökositler bulunur, diferansiyel oranlar nötrofiller %12, makrofajlar %0,9 ve lenfositler %0,1'dir6,7. İnsan sperminin incelenmesi ve işlenmesi için Dünya Sağlık Örgütü (WHO) laboratuvar kılavuzuna göre (5. baskı), lökositospermi genellikle menide >1 × 10⁶ hücre / mL lökosit varlığı olarak tanımlanır⁸. Bu durum, çevresel toksinler, madde bağımlılığı, varikoseller, MGTI'ler vb. gibi çok sayıda faktörden kaynaklanabilir ve bunların tümü potansiyel olarak semen^9'daki lökosit konsantrasyonunda anormal bir artışa yol açabilir. Lökositler, menideki reaktif oksijen türleri (ROS) seviyelerini yükseltebilir, lipid peroksidasyonuna ve protein ve DNA'da oksidatif hasara neden olabilir, bu da spermatozoa motilitesinin azalmasına, spermatozoa morfolojik anormalliklerinin artmasına, spermatozoa DNA fragmantasyon indeksinin yükselmesine, spermatozoa akrozom fonksiyonunun bozulmasına ve hatta embriyo gelişimi üzerinde olumsuz etkilere neden olabilir^10,11.

Şu anda, androloglar genital sistem iltihabını tanımlarken genellikle menideki yuvarlak hücreleri veya seminal plazmadaki elastazı incelemeyi tercih etmektedirler. Bununla birlikte, ayrım gözetmeyen ve gereksiz antibiyotik kullanımının azaltılmasına katkıda bulunmayan soyulmuş spermatojenik hücreleri ve üreme sistemi epitel hücrelerini ayırt etmek genellikle zordur⁶. İkinci muayene yöntemi, MGTI'ler gibi hastalıkların erken tanı ve tedavisi için faydalı olmayan, yavaş sonuç raporlaması ile nispeten karmaşık ve zaman alıcıdır. Amerikan Üroloji Derneği (AUA), semen analizindeki yuvarlak hücre konsantrasyonu 1 × 10⁶ hücre / mL^12'den büyük olduğunda, lökositler ve genital sistemden dökülmüş hücreler arasında daha fazla ayrım yapılması gerektiğini önermektedir. Bazı androloji laboratuvarları, lökositleri incelemek için akış sitometrisi¹³ veya lökosit antijeni (örneğin, CD45) immünositokimyası^14'ü kullanır. Bu yöntemler kesin olmakla birlikte, pahalı ve zaman alıcıdır, bu da özellikle gelişmekte olan ülkelerde büyük ölçekli klinik uygulamayı zorlaştırır.

Peroksidaz, çeşitli hücre tiplerinde yaygın olarak bulunur ve oksidatif stres hasarına karşı dirençte çok önemli bir rol oynar. Miyeloperoksidaz (MPO), genellikle bağışıklık hücrelerinde eksprese edilen peroksidaz alt ailesinin bir üyesidir. En yüksek oranda nötrofillerin azurofilik granüllerinde^15,16 eksprese edilir ve ayrıca lenfositlerde^17,18, monositlerde ve makrofajlarda¹⁹ eksprese edilir. Semende lökositlerin, özellikle nötrofillerin konsantrasyonu, peroksidaz pozitif olan yuvarlak hücrelerin incelenmesiyle elde edilebilir ^7,20. Semendeki lökositlerin inceleme sürecini ekonomik, kullanışlı ve verimli hale getirmek için inceleme yöntemini yeniden tasarladık. Bilgisayar destekli semen analizi (CASA) sistemi tarafından desteklenen lökosit konsantrasyonu 60 dakika içinde elde edilebilir. Bu yeni yöntem, hastaların muayene masraflarını ve sonuç almak için bekleme süresini azaltmakta, laboratuvar teknisyenlerinin iş yükünü hafifletmekte, doktorun tanı ve tedavi bekleme süresini kısaltmaktadır.

Bu çalışma, Sun Yat-sen Üniversitesi Üçüncü Bağlı Hastanesi Tıbbi Etik Kurulu tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Çalışma çözümünün hazırlanması

1. Çalışma çözeltisini hazırlamak için gerekli olan aşağıdaki reaktifleri toplayın - orto-toluidin substrat çözeltisi, doymuş amonyum klorür (_NH4Cl) çözeltisi, 148 mmol/L etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu (_Na2EDTA) çözeltisi ve %6 (h/h) hidrojen peroksit çözeltisi. Bunları, transfer pipetleri (1000 μL, 200 μL, 10 μL) ve test tüpü rafları gibi gerekli aletlerle birlikte oda sıcaklığında (RT) bir laboratuvar tezgahına yerleştirin.
   DİKKAT: Yukarıda belirtilen reaktifleri kullanmadan önce güvenlik bilgi formunu (SDS) okuyun.
2. Hazırlanan çalışma solüsyonunu ışığa maruz kalmaktan korumak ve saklamak için opak kahverengi bir reaktif şişesi hazırlayın.
3. Reaktifleri aşağıda belirtilen oranlara göre opak kahverengi reaktif şişesine aktarın:
   1. 200 μL transfer pipetini kullanın ve düğmeyi çevirerek ölçeği 100 μL'ye ayarlayın. Ardından, 100 μL_NH4Cl çözeltisini opak kahverengi reaktif şişesine aktarın.
   2. Pipet ucunu değiştirin ve yukarıda belirtilen 200 μL transfer pipetini kullanarak 148 mmol/L Na₂EDTA çözeltisinin 100 μL'sini opak kahverengi reaktif şişesine aktarın. Ardından, pipetleme ile hafifçe üfleyin ve çözeltiyi iyice homojenize edin.
   3. 1000 μL transfer pipetini kullanın ve düğmeyi çevirerek ölçeği 900 μL'ye ayarlayın. Ardından, 900 μL orto-toluidin substrat solüsyonunu opak kahverengi reaktif şişesine aktarın, pipetleyerek hafifçe üfleyin ve solüsyonu iyice homojenize edin.
   4. 10 μL'lik transfer pipetini kullanın ve düğmeyi çevirerek ölçeği 5 μL'ye ayarlayın. Ardından, %6 (h/h) hidrojen peroksit çözeltisinin 5 μL'sini opak kahverengi reaktif şişesine aktarın.
4. 1000 μL transfer pipetini kullanın ve düğmeyi çevirerek ölçeği 1000 μL'ye ayarlayın. Pipet ucunu değiştirin, pipetle hafifçe üfleyin ve opak kahverengi reaktif şişesindeki çözeltiyi iyice homojenize edin.
5. Kullanıma hazır çalışma solüsyonunu RT'deki opak kahverengi reaktif şişesinde ışıktan uzakta saklayın. Çalışma çözümü 24 saat boyunca reaktiftir.
6. Her semen örneği 900 μL çalışma çözeltisi gerektirir. Her gün hazırlanan çalışma solüsyonunun miktarının günlük olarak incelenen numune sayısına karşılık geldiğinden emin olun.

2. Semen örneğinin hazırlanması

1. Semen örneğini almadan önce, Dünya Sağlık Örgütü'nün (WHO) insan sperminin incelenmesi ve işlenmesi için laboratuvar kılavuzunun gerektirdiği şekilde hastanın 2 ila 7 gün boyunca boşalmadan kaçındığından emin olun (5. baskı). ⁸. Mastürbasyon, meni örnekleri elde etmek için tercih edilen yöntemdir. Muayenenin doğruluğunu artırmak için, hastaya boşalmış tüm menileri toplamasını söyleyin.
2. Sabit sıcaklık standını açın ve meni numunesinin sonraki sıvılaşmasının sorunsuz bir şekilde ilerleyebilmesi için önceden 37 °C'ye kadar ısıtın.
3. Hastanın meni örneğini aldıktan sonra, polimer bazlı kabın dış duvarına kimlik kodu, toplama süresi, yoksunluk süresi ve diğer ilgili bilgiler dahil olmak üzere ayrıntılı bilgileri titizlikle kaydedin.
4. Semen örneğini barındıran polimer bazlı kabı, meni sıvılaşması için faydalı olan 37 °C'ye ısıtılmış sabit sıcaklık standına yerleştirin.
5. Semen örneğini polimer bazlı bir pipete çekin ve semen örneği tamamen sıvılaşana kadar her 5 dakikada bir sıvılaşma durumunu gözlemleyin.
6. Semen örneği 30 dakika içinde tamamen sıvılaştırılmadıysa, muayeneyi henüz yapmayın; 30 dakika daha beklemeye devam edin. Meni 60 dakika sonra hala tam olarak sıvılaştırılmamışsa, 1:1 seyreltme için eşit hacimde fosfat tampon çözeltisi ekleyin ve sıvılaşmayı teşvik etmek için hafifçe çalkalayın.
7. Kapsamlı çalkalama ve tutarlı homojenizasyondan sonra, sonraki inceleme prosedürleri için tamamen sıvılaştırılmış semen örneğini saklayın.

3. Peroksidaz pozitif lökositlerin boyanması ve orijinal semen örneğinin analiz edilmesi

1. Numune almadan önce, pipetleme ile tekrar tekrar üflemek için polimer bazlı bir pipet kullanın ve incelenen semen örneğini iyice homojenize edin.
2. 200 μL transfer pipetini kullanın ve düğmeyi çevirerek ölçeği 100 μL'ye ayarlayın. Pipet ucunu değiştirin ve ardından 100 μL semen örneğini bir santrifüj tüpüne aktarın.
3. 1000 μL transfer pipetini kullanın ve düğmeyi çevirerek ölçeği 900 μL'ye ayarlayın. Pipet ucunu değiştirin, ardından yukarıda belirtilen çalışma solüsyonunun 900 μL'sini santrifüj tüpüne aktarın.
4. Pipetleme ile tekrar tekrar üfleyin ve 1000 μL transfer pipeti kullanarak semen numunesi ve çalışma solüsyonundan oluşan reaktanı iyice homojenize edin.
5. Santrifüj tüpünü iki boyutlu bir çalkalayıcı üzerinde bir test tüpü rafına yerleştirin ve RT'de 30 dakika boyunca 200 rpm'de sürekli çalkalamaya maruz bırakın.
6. Boyama reaksiyonunu beklerken, polimer bazlı kaptaki orijinal semen örneğindeki spermatozoa konsantrasyonunu belirlemek için CASA sistemini kullanarak semen örneğini analiz edin.
   1. CASA sisteminin güç anahtarını açın ve uygulama yazılımını açmak için SCA SCOPE simgesine çift tıklayın.
   2. Numune almadan önce, pipetleme ile tekrar tekrar üfleyin ve orijinal semen numunesini polimer bazlı bir pipetle tekrar iyice homojenize edin.
   3. 10 μL transfer pipetini kullanın ve düğmeyi çevirerek ölçeği 10 μL'ye ayarlayın. Pipet ucunu değiştirin, orijinal semen örneğinden 10 μL'ye kadar pipetleyin ve SCA sayım odasına yerleştirin. Semen örneğinin sürüklenmesinin durması için 60 saniye bekleyin.
   4. SCA sayım odasını CASA sisteminin numune tutucusuna yerleştirin ve resmi muayeneye hazırlanmak için uygulama yazılımının iletişim kutusunda hastanın bilgilerini ayarlayın.
   5. Başlat düğmesine tıklayarak SCA sayım odasındaki orijinal semen örneğini CASA sistemi ile inceleyin ve spermatozoa konsantrasyonu gibi gerekli verileri kaydedin.

4. Peroksidaz pozitif lökositlerin ve spermatozoaların gözlenmesi

1. 1000 μL transfer pipetini kullanın ve düğmeyi çevirerek ölçeği 1000 μL'ye ayarlayın. Pipet ucunu değiştirin, ardından pipetleme ile tekrar tekrar üfleyin ve 30 dakikalık reaksiyon işleminin sonunda santrifüj tüpünde semen numunesi ve çalışma solüsyonundan oluşan reaktanı iyice homojenize edin.
2. 10 μL transfer pipetini kullanın ve düğmeyi çevirerek ölçeği 10 μL'ye ayarlayın. Pipet ucunu değiştirin, yukarıda belirtilen reaktandan 10 μL'ye kadar pipetleyin ve sperm sayma odasına yerleştirin. Son olarak, sperm sayma odasını özel bir cam lamel ile örtün.
3. Sperm sayma odasını mikroskobik sahneye yerleştirin ve iki adet 10x göz merceği ile optik mikroskobun güç anahtarını açın. Ardından, reaktan numunesinin sürüklenmeyi durdurması için 60 saniye bekleyin.
4. Bekleme süresi boyunca mikroskobik dönüştürücüyü 10x objektif merceğe geçirin. Ardından kaba ayar düğmesini ve ince ayar düğmesini sırayla ayarlayın. Son olarak, spermatozoa ve yuvarlak hücreleri 10×10 büyütme altında gözlemleyin.
5. Analiz edilecek görüş alanını belirledikten sonra mikroskobik dönüştürücüyü 40x objektif merceğe geçirin ve spermatozoa ve kahverengi peroksidaz pozitif lökositleri 10 × 40 büyütme altında gözlemleyin.
6. İlgili alanlarda en az 200 spermatozoa ve kahverengi peroksidaz pozitif lökosit sayısını saymak için elektronik sayaç sistemini kullanın.

5. Peroksidaz pozitif lökosit konsantrasyonunun hesaplanması

1. Aşağıdaki formülü kullanarak peroksidaz pozitif lökositlerin konsantrasyonunu hesaplayın:
   

Yukarıda belirtilen prosedürün uygulanmasının ardından, santrifüj tüpündeki reaktan sıklıkla yarı saydam, yanardöner bir görünüm gösterir (Şekil 1). Açıkça kahverengi bir rengin tespit edilmesi, lökositlerin potansiyel degranülasyonunu ortaya çıkarır ve bu da sıvı lekelenmesine neden olabilir. Sonuç olarak, boyama işlemi başarısız olabilir ve bu da yeniden test etmek için yeniden boyamayı veya yeni bir semen örneği toplamayı gerekli kılar21.

Peroksidaz pozitif lökositler, boyanmamış sıradan yuvarlak hücrelerle kontrast oluşturan kahverengi bir renk tonu sergilediler (Şekil 2, sıradan slayt). Daha sonra, mevcut mikroskop alanı altındaki her spermatozoon ve kahverengi lökosit, sürekli gözlem ve çetele için tamamen yeni bir alana geçmeden önce sayıldı. Optimum doğruluğu sağlamak için, en az 200 spermatozoa ve ilgili görüş alanında bulunan lökositleri saymak gerekir.

Şekil 1: Reaktan çözeltisi. Reaksiyon sürecini tamamlayan reaktan, yarı saydam yanardöner bir sıvıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 2: Optik mikroskop altında gözlem (normal slayt). (A) Peroksidaz pozitif lökosit ve (B) 10 x 40 büyütmeli optik mikroskopta gözlenen sıradan yuvarlak hücre. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.