OVA'ya özgü sistemik ve mukozal yanıtları teşvik etmek için bir adjuvan olarak katyonik nanoemülsiyon kapsüllenmiş retinoik asit

Adjuvanlar genellikle bağışıklık sistemini aşıya daha güçlü yanıt vermesi için uyararak ve böylece belirli bir patojene karşı bağışıklığı artırarak bir aşının etkinliğini arttırmak için kullanılır¹. Nanoemülsiyon (NE) adjuvanı, yağda su (W/O) veya suda yağ (O/W)² şeklinde bir emülsiyon üretmek için belirli bir oranda yağ fazı ve sulu fazı emülsifiye ederek termodinamik stabiliteye sahip bir kolloidal dispersiyon sistemini ifade eder. O / W nanoemülsiyon adjuvanı, enjeksiyon bölgesinde sitokinler ve kemokinler üretebilir, monositler, nötrofiller ve eozinofiller gibi önemli bağışıklık hücrelerinin hızlı agregasyonunu ve proliferasyonunu indükleyebilir ve bağışıklık tepkisini artırabilir ve antijenlerin immünojenisitesini artırabilir³. Şu anda, üç nanoemülsiyon adjuvanı (MF59, AS03 ve AF03) aşılarda kullanım için lisanslanmıştır ve iyi güvenlik ve etkinlik göstermiştir⁴.

Bununla birlikte, mukozal bağışıklık, konvansiyonel parenteral aşılamada şu anda lisanslı adjuvan formülasyonlar tarafından yetersiz bir şekilde ele alınmıştır⁵. Retinoik asidin (RA) bağışıklık hücrelerinin bağırsak güdümünü indüklediği bildirilmiştir, ancak düşük polaritesi, suda zayıf çözünürlüğü ve zayıf ışık ve termal stabilitesi, sağlam enterik aşılama için kullanımını sınırlar. Nanoemülsiyonlar, yüksek derecede lipofilik ilaçların biyoyararlanımını arttırma fırsatları sunar ve O / W emülsiyon adjuvanlarının yağ çekirdeği, RA⁶ gibi polar olmayan maddelerin çözülmesi için uygundur. Bu nedenle, nanoemülsiyonlar, sistemik bağışıklık ve mukozal bağışıklığın ikili yanıt etkisini elde etmek için RA için taşıyıcı olarak kullanılabilir.

Nötr veya anyonik dağıtım sistemleriyle karşılaştırıldığında, katyonik dağıtım sistemleri, antijenlerin ^7,8,9 immünojenisitesini artırabilen nispeten verimli antijen kapsülleme ve verme yeteneklerine sahiptir. Çeşitli adjuvan sistemlerin katyonik yüzey yükü, adjuvan etkileri için önemlidir 10,11,12. Katyonik yük, enjeksiyon bölgesinde aşı tutulma süresinin uzaması, antijen sunumunun arttırılması ve vücuttaki hücresel bağışıklığın uyarılmasının uzamasında önemli bir faktördür¹².

Yukarıdaki hususlara dayanarak, RA ve antijenleri etkili bir şekilde birlikte iletmek için katyonik bir nanoemülsiyon geliştirdik. Nanoemülsiyonun partikül boyutu ve zeta potansiyeli, dinamik ışık saçılımı (DLS) kullanılarak belirlendi ve OVA ile kombine edilen nanoemülsiyonun sistemik ve mukozal immün yanıtları intramüsküler enjeksiyon¹³ ile değerlendirildi.

Hayvan deneyleri, Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımı ve Bakımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Üçüncü Askeri Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Refahı ve Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. Nanoemülsiyonların (NE'ler) hazırlanması

1. Sulu faz hazırlığı için, 40 ° C'de karıştırırken 0.15 g polisorbat 80'i 28.2 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözün.
2. Yağ fazı hazırlığı için, Tablo 1'de gösterilen nanoemülsiyonun yağ fazı formülasyonunu kullanın. Sornitan trileat 85, DOTAP ve RA'yı 40 °C'de karıştırarak skualen içinde çözün.
3. Birincil O / W emülsiyon hazırlığı için, yağ fazını 1400 rpm'de manyetik olarak karıştırın ve suluyu 1 mL / dak hızında yavaş ve damla damla ekleyin. Karışımı 6 dakika boyunca 30.000 rpm'de yüksek parçalayıcılı bir emülgatör kullanarak önceden emülsifiye edin.
4. Yüksek basınçlı homojenizasyon (HPH) için, 160-190 nm aralığında homojen bir nano emülsiyon elde etmek için yukarıda hazırlanan birincil O/W emülsiyonunu yüksek basınçlı homojenizatör ile 900 bar'da 12 döngü boyunca işlemden geçirin.
5. İşlemin sonunda, emülsiyonu 50 mL'lik bir şişede toplayın ve emülsiyonu 0,2 μm'lik bir PES filtre membranından filtreyle sterilize edin.
6. Şişeyi kateter aracılığıyla Schlenk Hattına bağlayın, sistemi vakum tüpüne bağlamak için üç vanayı döndürün ve şişede vakum oluşturmak için vakum pompasını açın. Ardından, üç vanayı döndürerek sistemi Argon tüpüne bağlayın ve Argon ile doldurun. Şişenin Argon ile doldurulduğundan emin olmak için bu adımı 3 kez tekrarlayın.
7. Mantarı değiştirin ve bir parafin film ile kapatın, şişeyi kalay folyoya sarın ve 4 °C'de saklayın.

2. Nanoemülsiyonların karakterizasyonu

1. Partikül boyutu ve zeta potansiyeli tespiti
   1. Cihazı AÇIN ve lazer ışık kaynağının sabitlenmesi için 30 dakika bekleyin.
   2. NE'yi 50 kat ultra saf suyla seyreltin ve karşılık gelen numune hücresine 1 mL numune ekleyin.
   3. Partikül boyutunu ölçmek için sıcaklığı 25 °C'ye ayarlayın, dispersiyon ortamı olarak suyu seçin ve ölçüm hücresi olarak tek kullanımlık plastik tabakları seçin. Numuneleri yükleyin ve otomatik olarak ölçün. Nihai sonuç olarak her numune için tekrarlanan üç ölçümün ortalama değerini rapor edin.
   4. Zeta potansiyelinin ölçümü için sıcaklığı 25 °C'ye ayarlayın. Dispersiyon ortamı olarak sulu fazın seçilmesi nedeniyle, ölçüm hücresi olarak Smoluchowsi modelini ve katlanmış kılcal hücreyi seçin. Numuneleri yükleyin ve otomatik olarak ölçün. Nihai sonuç olarak her numune için üç tekrarlanan ölçümün ortalamasını raporlayın.
2. Kapsülleme oranı ve ilaç yükleme hızının belirlenmesi
   1. NE'ye yüklenen RA miktarını belirlemek için, RA'yı NE'den emülsifiye etmek ve çıkarmak için mutlak etanol kullanın. 5 μL numuneye 995 μL etanol ekleyin ve 355 nm'de bir spektrofotometre kullanarak çözeltinin RA içeriğini belirleyin. Absorbansı standart bir eğri ile karşılaştırın. Aşağıdaki denklemi kullanın:
      Kapsülleme = gerçek RA yükü / eklenen ilacın ağırlığı
      İlaç yükleme hızı = gerçek RA yüklemesi / numunenin kalitesi

3. Bağışıklama prosedürleri ve numune toplama

1. Bağışıklama prosedürü ve gruplama
   1. Aşağıdaki deney gruplarına göre 0. gün, 14. gün, 28. günde aşılama için 6-8 haftalık ve yaklaşık 18-21 g ağırlığındaki dişi Balb/C farelerini 5'li setler halinde gruplayın: (1) PBS grubu, (2) ovalbümin (OVA) grubu, (3) OVA+ NE-RA (OVA/ NE-RA) grubu, (4) OVA+CNE-RA(OVA/CNE-RA) grubu.
   2. Tüm fareleri, 200 μL farklı aşı formülasyonları ile üst kuadriseps kaslarına intramüsküler enjeksiyonla aşılayın: 100 μL emülsiyon ve 100 μL PBS içinde emilen 15 μg OVA, uygulamadan önce karıştırılır. 100 μL / arka bacak enjekte edin. Kontrol grubundaki fareler için PBS'yi tek başına uygulayın.
   3. Ötenazi: Üç aşılamanın tamamlanmasından 2 hafta sonra tüm fareleri 100 mg / kg% 1 sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksiyonla ötenazi yapın.
   4. Numune toplama ve işleme: Ötenaziden sonra, farelerin göğsünü kesmek için makas kullanın ve yaklaşık 0.5 mL tam kan aspire etmek için doğrudan kalbe bir şırınga yerleştirin. Kanın oda sıcaklığında 2 saat bekletin ve ardından 1800 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Serum, alikot toplayın ve daha fazla analiz için -80 ° C'de saklayın.
   5. Tam kan, dalak, vajinal lavaj sıvısı (VLF), bronkoalveoler lavaj sıvısı (BALF), nazal lavaj sıvısı (NLF) ve ince bağırsak lavaj sıvısını (SILF) toplayın.
2. Dalak lenfositlerinin izolasyonu
   1. Fareleri etanole batırın %75 (h/h) Kısa bir sterilizasyon için fareleri temiz bir tezgaha aktarın. Sol karın bölgesindeki cildi makasla kesin, dalağı açığa çıkarın ve çıkarın.
   2. Dalağı 3 mL PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin, öğütün ve bir elek (200 göz, 70 μm) ve öğütme çubuğu kullanarak 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne süzün.
   3. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 650 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve çökeltiyi 3 mL kırmızı kan hücresi lizis çözeltisi ile askıya alın, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
   4. Tüpe 10 mL PBS ekleyin ve reaksiyonu sonlandırmak için iyice çalkalayın, ardından oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 650 x g'da santrifüjleyin.
   5. Süpernatanı atın ve hücreleri 10 mL PBS'de yeniden süspanse edin, hücre sayımı için otomatik hücre sayacına 20 μL hücre seyreltmesi ekleyin.
   6. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 650 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 1640 tam ortam (% 1 penisilin-streptomisin,% 10 fetal sığır serumu) ile 1 x^{10 6} hücre / mL'ye seyreltin.
3. VLF toplama: Vajinayı 4x 75 μL %1 BSA/PBST ile durulayın, lavaj solüsyonunu birleştirin ve 1.5 mL santrifüj tüplerinde toplayın, 5000 x g'da 4 ° C'de 20 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı bir pipetle toplayın ve -80 ° C'de saklayın.
4. BALF ve NLF koleksiyonu
   1. Kurban edildikten sonra fareleri %75 (h/h) etanol ile dezenfekte edin. Farenin karnını yukarıda tutun ve boynunu düzeltin. Fare boynunun derisinde uzunlamasına bir kesi yapmak için makas kullanın ve kasları ayırmak ve trakeayı yeterince açığa çıkarmak için forseps kullanın.
   2. Trakeayı küçük bir enine açıklıktan kesin ve hortumu akciğerlere doğru yerleştirin, şırıngayı hortuma takın ve akciğerlere 0,5 mL PBS enjekte edin ve geri çekin, durulamayı 3x tekrarlayın ve 650 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı (BALF) -80 ° C'de saklayın.
   3. Hortumu burun boşluğuna ters çevirin, şırıngayı hortuma takın ve 0,5 mL PBS enjekte edin, sıvı burun boşluğundan 1,5 mL santrifüj tüpüne akacaktır. Yıkamayı santrifüj tüpünden aspire edin ve durulamayı 2 kez tekrarlayın, ardından 650 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı (NLF) -80 ° C'de saklayın.
5. SILF koleksiyonu
   1. İnce bağırsak lavaj çözeltisi olarak 0.1 mg / mL tripsin inhibitörü, 50 mM / L EDTA-2Na, 1 mM / L fenilmetilsülfonil florür (PMSF) içeren PBS çözeltisi hazırlayın. Çözünmesi için oda sıcaklığında karıştırın ve 4 °C'de saklayın.
   2. İnce bağırsağı bağırsak borusu boyunca kesin ve 3 mL ince bağırsak lavaj sıvısına daldırın. 4 °C'de 30 dakika boyunca 15 rpm'de dikey çalkalayarak karıştırın. 20 dakika boyunca 4 ° C'de 1440 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı bir pipetle toplayın, ardından 20 dakika boyunca 4 ° C'de 5000 x g'de santrifüjleyin. Süpernatanı (SILF) -80 °C'de saklayın.

4. İntramüsküler uygulamadan sonra OVA'ya özgü antikor yanıtının değerlendirilmesi

1. Enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile IgG'nin serum düzeylerini, IgG1, IgG2a'nın alt sınıflarını ve VLF, BALF, NLF ve SILF'deki spesifik sIgA düzeylerini belirleyin.
2. Antijen kaplaması için, OVA'yı kaplama tamponu ile 5 μg/mL'ye seyreltin ve 96 oyuklu ELISA plakalarını gece boyunca 4 °C'de oyuk başına 100 μL OVA çözeltisi ile kaplayın.
3. ELISA plakalarını 5x PBST ile yıkayın ve 250 μL %1 BSA/PBST ile 37 °C'de 2 saat inkübe ederek bloke edin.
4. ELISA plakalarını 5x PBST ile yıkayın, ardından test edilmek üzere aşağıda açıklandığı gibi seyreltilmiş numuneden 100 μL ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Serum, VLF, BALF, NLF'yi %0.5 BSA/PBST ile seyreltin, SILF'i %20 fetal buzağı serumu (FCS)/PBST ile seyreltin.
   1. İki aşamalı bir seyreltme prosedürü kullanarak serumu 1000x seyrelterek başlayın: 20 μL serumu 1 mL'ye seyreltin, ardından bu seyreltilmiş serumun 25 μL'sini 500 μL'ye seyreltin. IgG1, IgG2a'nın tespiti için bu serum seyreltmesini kullanın.
5. Kaplanmış plakanın ilk sırasına 1000x'te seyreltilmiş 200 μL serum ekleyin ve ilk sıra hariç tüm oyuklara 100 μL% 0.5 BSA / PBST ekleyin. İlk sıradan ikinci sıraya 100 μL aktarın ve 10x'i pipetle karıştırın. Bu adımı 8. sıraya kadar tekrarlayın ve 100 μL sıvıyı atın, IgG'nin tespiti için farklı konsantrasyonlarda serum elde edilmiştir.
6. IgA'yı tespit etmek için BALF, NLF ve SILF'nin 1: 1 seyreltmesini gerçekleştirin. VLF için serum ile aynı seyreltme prosedürünü kullanın.
7. ELISA plakalarını 5x PBST ile yıkayın. Uygun kuyucuklara 100 μL HRP konjuge keçi fare karşıtı IgG / IgG1 / IgG2a / IgA (PBST ile 1:10000 seyreltilmiş) ekleyin ve 37 ° C'de 40 dakika inkübe edin.
8. ELISA plakalarını 5x PBST ile yıkayın, 100 μL TMB ELISA substratı (çok hassas) ekleyin ve plakayı 5 dakika boyunca ışıktan korunan bir yere aktarın. Reaksiyonu durdurmak için TMB substratı için hemen 100 μL 450 nm durdurma çözeltisi ekleyin.
9. Her kuyucuk için 450 nm'de absorbansı (OD) ölçün ve pozitif yanıt değeri olarak boş grup farenin serum değerinin 2.1 katını alarak antikor titresini hesaplayın.

5. ELISpot testi

1. ELISpot Plus yönergelerini izleyin, tahlilleri gerçekleştirmek için kitten Fare IFN-γ (ALP) kullanın.
2. Plakayı kapalı ambalajından çıkarın ve 4x'i steril PBS (200 μL/kuyu) ile yıkayın. Plakayı 1640 tam ortam (200 μL / kuyu) ile şartlandırın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
3. Ortamı çıkarın ve adım 3.2.2'de (100 μL / kuyucuk) hazırlanan ayarlanmış lenfosit süspansiyon konsantrasyonunu plakaya ekleyin, daha sonra 100 μL uyaran ekleyin, yani 20 μg / mL OVA257 ~ 264 veya OVA323 ~ 339 veya 1640 tam ortam içeren 1640 tam ortam. Plakayı 37 ° C'de% 5 CO₂ ile 48 saat boyunca nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. Buharlaşmayı önlemek için plakayı alüminyum folyo ile sarın.
4. Hücre süspansiyonunu atın ve plakayı 5x PBS (200 μL/kuyu) ile yıkayın. Tespit antikorunu (R4-6A2-biotin)% 0.5 fetal buzağı serumu (PBS-% 0.5 FCS) içeren PBS'de 1 μg / mL'ye seyreltin. 100 μL/kuyu ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
5. Plakayı adım 5.2'deki gibi yıkayın. Streptavidin-ALP'yi (1:1000) PBS-0.5% FCS içinde seyreltin ve 100 μL / kuyu ekleyin, oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
6. Plakayı adım 5.2'deki gibi yıkayın. Kullanıma hazır substrat çözeltisini (BCIP/NBT-plus) 0,45 μm'lik bir filtreden süzün ve 100 μL/kuyucuk ekleyin. Farklı noktalar ortaya çıkana kadar geliştirin.
7. Musluk suyunda yoğun bir şekilde yıkayarak renk oluşumunu durdurun, yumuşak plastiği çıkarın ve plakayı kurumaya bırakın.
8. Bir ELISpot okuyucusunda noktaları inceleyin ve sayın.

6. İstatistiksel analiz

1. 4 grubun verileri arasındaki farklılıklar tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey çoklu karşılaştırma son testi ile analiz edilmiştir. Tüm sonuçları ortalama ± SD olarak ifade edin. P değerinin 0.05'ten küçük olması anlamlı kabul edildi.

Toplamda, dört nanoemülsiyon formülasyonu hazırlanmış ve Tablo 2'de sunulduğu gibi partikül boyutları (Şekil 1), zeta potansiyelleri ve kapsülleme verimlilikleri ile karakterize edilmiştir. Parçacık boyutu 160-190nm civarında konsantre edildi ve DOTAP ilavesi nanoemülsiyonun Zeta potansiyelini tersine çevirdi. OVA'ya özgü serum IgG ve serumdaki alt grup antikor düzeyi üçüncü aşılamadan 2 hafta sonra tespit edildi. Nanoemülsiyon adjuvan aşı, serumda OVA'ya özgü IgG, IgG1 ve IgG 2a antikor titrelerini önemli ölçüde arttırdı (Şekil 2). Daha da önemlisi, vajinal lavaj sıvısı ve ince bağırsak lavaj sıvısındaki spesifik sIgA seviyeleri, OVA CNE-RA ile adjuvan edildiğinde önemli ölçüde artmıştır (Şekil 3). ELISpot testinde önemli bir nokta bulunamadı.

Şekil 1: Boyut, çap ve dağılım. (A) NE-RA'nın boyutu, çapı ve dağılımı. (B) CNE-RA'nın boyutu, çapı ve dağılımı. d.nm, parçacıkların nm cinsinden ortalama çapıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Serumda OVA'ya özgü serum IgG ve alt grup antikor seviyeleri. Üç aşılamanın tamamlanmasından 2 hafta sonra serumda OVA'ya özgü serum IgG ve alt grup antikor seviyeleri. (A) IgG titrelerinin Log2 değeri. (B) 450 nm'de IgG1 optik yoğunluğu. (C) 450 nm'de IgG2a optik yoğunluğu. Veriler ortalama ± SD (n=5), ***: P<0.001 olarak ifade edildi. Gruplar ve PBS grubu arasındaki farkların karşılaştırmaları, şekildeki sütunların hemen üzerinde gösterilir ve aşağıdaki gibi gösterilir: ns: anlamlılık yok, #p<0.05, ###p<0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: OVA'ya özgü sIgA. Vajinal lavaj sıvısı, bronkoalveoler lavaj sıvısı, burun lavaj sıvısı, ince bağırsak lavaj sıvısında OVA'ya özgü sIgA. (A) Vajinal lavaj sıvısı, (B) bronkoalveoler lavaj sıvısı, (C) Burun lavaj sıvısı ve (D) ince bağırsak lavaj sıvısı. Veriler ortalama ± SD (n=5), ns: anlamlılık yok, *p<0.05; Sayfa<0.001. Gruplar ve PBS grubu arasındaki farkların karşılaştırmaları, şekildeki sütunların hemen üzerinde gösterilir ve aşağıdaki gibi gösterilir: ns: anlamlılık yok, ###p<0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: NE'lerin yağ fazı formülasyonu.

Tablo 2: NE'lerin fizikokimyasal özellikleri.

Yazarlar bu çalışmada herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.