İnsan Kök Hücre Bakımı ve Bağırsak Organoid Üretimi için Bazal Membran Matrislerinin Karşılaştırmalı Çalışması
Özet
Organoidler, hastalık modellemesi için değerli araçlar haline geldi. Hücre dışı matris (ECM), organoid üretimi sırasında hücre kaderini yönlendirir ve doğal dokuya benzeyen bir sistem kullanmak model doğruluğunu artırabilir. Bu çalışma, hayvan kaynaklı ECM ve kseno içermeyen hidrojellerde indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetilmiş insan bağırsak organoidlerinin üretimini karşılaştırmaktadır.
Abstract
Hücre dışı matriks (ECM), hücre davranışı ve gelişiminde kritik bir rol oynar. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC’ler) üretilen organoidler birçok araştırma alanının ilgi odağındadır. Bununla birlikte, klasik hücre kültürü materyallerinde fizyolojik ipuçlarının olmaması, verimli iPSC farklılaşmasını engellemektedir. Ticari olarak temin edilebilen ECM’nin kök hücre kültürüne dahil edilmesi, hücre bakımı için faydalı fiziksel ve kimyasal ipuçları sağlar. Hayvansal kaynaklı ticari olarak temin edilebilen bazal membran ürünleri, hücre bakımını destekleyen ECM proteinleri ve büyüme faktörlerinden oluşur. ECM, hücre kaderini modüle edebilen dokuya özgü özelliklere sahip olduğundan, klinik çalışmalara translasyonu sağlamak için kseno içermeyen matrisler kullanılır. Ticari olarak temin edilebilen matrisler hiPSC ve organoid çalışmalarında yaygın olarak kullanılırken, bu matrislerin eşdeğerliği henüz değerlendirilmemiştir. Burada, dört farklı matriste hiPSC idame ve insan bağırsak organoidleri (hIO) oluşumunun karşılaştırmalı bir çalışması yapılmıştır: Matrigel (Matris 1-AB), Geltrex (Matris 2-AB), Cultrex (Matris 3-AB) ve VitroGel (Matris 4-XF). Koloniler mükemmel yuvarlak bir şekle sahip olmasalar da, hücrelerin %85’inden fazlasının kök hücre markörü SSEA-4’ü eksprese etmesiyle minimal spontan farklılaşma vardı. Matrix 4-XF, 3D yuvarlak kümelerin oluşumuna yol açtı. Ayrıca, Matrix 4-XF hidrojel çözeltisini yapmak için kullanılan ortamdaki takviye ve büyüme faktörlerinin konsantrasyonunun arttırılması, SSEA-4’ün hiPSC ekspresyonunu 1.3 kat iyileştirdi. Matris 2-AB ile korunan hiPSC’nin farklılaşması, diğer hayvan türevli bazal membranlara kıyasla orta/arka bağırsak aşamasında daha az sferoid salınımına yol açtı. Diğerleriyle karşılaştırıldığında, kseno içermeyen organoid matris (Matris 4-O3) daha büyük ve daha olgun hIO’ya yol açar, bu da kseno içermeyen hidrojellerin fiziksel özelliklerinin organoid oluşumunu optimize etmek için kullanılabileceğini düşündürür. Toplamda, sonuçlar, farklı matrislerin bileşimindeki varyasyonların IO farklılaşmasının aşamalarını etkilediğini göstermektedir. Bu çalışma, ticari olarak temin edilebilen matrislerdeki farklılıklar hakkında farkındalık yaratır ve iPSC ve IO çalışmaları sırasında matris optimizasyonu için bir kılavuz sağlar.
Introduction
Hücre dışı matriks (ECM), hücre davranışını ve gelişimini düzenlemede merkezi bir rol oynayan dokuların dinamik ve çok işlevli bir bileşenidir. Karmaşık bir ağ olarak, yapısal destek, hücre yapışkan ligandları1 ve hücre sinyallemesini düzenleyen büyüme faktörlerinin ve sitokinlerin depolanmasını sağlar. Örneğin, yara iyileşmesi sırasında, ECM, göç eden hücreler için bir iskele görevi görür ve doku onarımında yer alan büyüme faktörlerinin bir rezervuarı olarak işlev görür2. Benzer şekilde, ECM’deki düzensizlik, fibroz ve kanser gibi çeşitli hastalıkların şiddetinde bir artışa yol açabilir 3,4. Embriyonik gelişim sırasında, ECM doku morfogenezine rehberlik eder. Örneğin, kalbin gelişiminde, ECM bileşenleri kalp dokusunun doğru mimarisini ve işlevini oluşturmada rol oynar5. On yıldan fazla bir süredir yapılan araştırmalar, mikro çevrenin sertliğinintek başına 6,7’nin kök hücre soy spesifikasyonunu kontrol edebileceğini göstermiştir. Bu nedenle, in vitro hücre farklılaşması sırasında ECM’nin farklılaşma için sinyaller sağlayarak kök hücre kaderini etkilemesi şaşırtıcı değildir.
Organoidler, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC’ler) üretilebilir. Organoidleri başarılı bir şekilde oluşturmak için uygun şekilde karakterize edilmiş bir iPSC hattı ile başlamak gerekir. Bununla birlikte, klasik hücre kültürü materyallerinde fizyolojik ipuçlarının eksikliği, verimli iPSC farklılaşmasını ve organoid oluşumunu engeller. Ayrıca, son araştırmalar, organoid genişleme ve farklılaşma 12 bağlamında hücre dışı matrisin (ECM) bileşiminin, hücreler ve ECM8 arasındaki etkileşimlerin yanı sıra mekanik ve geometrik ipuçlarının 9,10,11 önemini vurgulamıştır. Tekrarlanabilirliği artırarak organoid teknolojisini ilerletmek, dokuya özgü fiziksel ve kimyasal ipuçlarının dahil edilmesini içerecektir.
Organoidler, doğal dokuyu fizyolojik olarak benzer bir mikro çevre içinde özetlemeyi amaçlar. Doğal doku ECM’sini yakından taklit eden bir ECM sistemi seçmek, hücre davranışı, işlevi ve uyaranlara yanıt ile ilgili fizyolojik alaka düzeyini elde etmek için çok önemlidir13. ECM bileşenlerinin seçimi, kök hücrelerin organoid içindeki belirli hücre tiplerine farklılaşmasını etkileyebilir. Farklı ECM proteinleri ve bunların kombinasyonları, hücre kaderini yönlendiren ipuçları sağlayabilir14. Örneğin, çalışmalar, spesifik ECM bileşenlerinin kullanılmasının, bağırsak kök hücrelerinin olgun bağırsak hücre tiplerine farklılaşmasını teşvik edebileceğini ve bunun fizyolojik olarak ilgili bağırsak organoidleri ile sonuçlanabileceğini göstermiştir15. Organoidler, hastalık modellemesi ve ilaç testi sırasında değerli bir araç olsa da, uygun bir ECM sisteminin seçilmesi bu uygulama için çok önemlidir. Uygun bir ECM sistemi, etkilenen dokuya benzeyen bir mikro çevre yaratarak hastalık modellemesinin doğruluğunu artırabilir16. Ayrıca, dokuya özgü ECM, hastalıkla ilişkili fenotipleri ve ilaç yanıtlarını daha iyi özetleyen organoidlerin üretilmesine yardımcı olabilir17. Organoid farklılaşmasında kullanılan ECM sisteminin optimize edilmesi, istenen farklılaşma sonuçlarının elde edilmesi için kritik öneme sahiptir.
Hayvansal ECM kaynaklarından (örneğin, Matrigel, Cultrex) ve kseno içermeyen hidrojelden (örneğin, VitroGel) türetilen ticari olarak temin edilebilen bazal membran sistemleri, iPSC ve organoid araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bunları ticarileştiren şirketler ve bunları kullanan araştırmacılar, yıllar boyunca kendi özel ürünleri ve uygulamaları için birçok talimat ortaya koymuşlardır. Bu talimatların çoğu, bu protokolün oluşturulması için bir rehber görevi gördü. Ayrıca, içsel özellikleriyle ilişkili faydalar ve aksilikler birçok 18,19,20,21 tarafından ayrı ayrı belirtilmiştir. Bununla birlikte, iPSC ve organoid çalışmaları için en uygun sistemlerin seçimine rehberlik edecek sistematik bir iş akışı yoktur. Burada, iPSC ve organoid çalışmaları için çeşitli kaynaklardan ECM sistemlerinin eşdeğerliğini sistematik olarak değerlendirmek için bir iş akışı sağlanmaktadır. Bu, dört farklı matriste iki farklı insan iPSC hattının (hiPSC) ve insan bağırsak organoidlerinin (hIO) oluşumunun sürdürülmesinin karşılaştırmalı bir çalışmasıdır: Matrigel (Matris 1-AB), Geltrex (Matris 2-AB), Cultrex (Matris 3-AB) ve VitroGel (Matris 4-XF). Organoid kültür için, daha önce organoid kültür için optimize edilmiş kseno içermeyen matris VitroGel’in dört versiyonu kullanıldı: ORGANOID 1 (Matris 4-O1), ORGANOID 2 (Matris 4-O2), ORGANOID 3 (Matris 4-O3), ORGANOID 4 (Matris 4-O4). Ayrıca, organoidler için optimize edilmiş hayvan türevli matrisler kullanıldı: Matrigel Yüksek Konsantrasyon (Matris 1-ABO) ve Cultrex Tip 2 (Matris 3-ABO). Piyasada bulunan kök hücre kültür ortamı (mTeSR Plus) ve organoid farklılaşma kiti (STEMdiff intestinal organoid kit) kullanıldı. Bu protokol, okuyucuyu belirli iPSC ve organoid çalışmaları için ECM’nin başarılı bir şekilde optimizasyonuna yönlendirmek için ürün üreticilerinin bireysel talimatlarını laboratuvar deneyimleriyle birleştirir. Toplamda, bu protokol ve temsili sonuçlar, kök hücre çalışması ve organoid farklılaşması için en uygun mikro ortamın seçilmesinin önemini vurgulamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kök hücre ve organoid çalışmaları için en uygun mikro ortamın seçilmesi, bu platformları çok çeşitli uygulamalar için kullanırken çok önemli bir erken adımdır. Temsili sonuçlarımız, Matrix 4-XFO3’ün daha yüksek konsantrasyonda büyüme faktörleri ile kombinasyon halinde daha büyük organoidlere yol açtığını göstermektedir, bu da kseno içermeyen hidrojellerin fiziksel özelliklerinin bu sistemler kullanılarak organoid üretimini optimize etmek için kullanılabileceğini düşündürmekte…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Dr. Christina Pacak, Silveli Susuki-Hatano ve Russell D’Souza’dan hiPSC ve organoid çalışmalarına başlama ile ilgili önceki eğitimleri ve genel önerileri kabul etmektedir. İn vitro hücre kültürü çalışmaları için hidrojel sistemlerini kullanma konusundaki rehberliği için Dr. Chelsey Simmons’a teşekkür ederler. Ayrıca yazarlar, STEMCELL Technologies’den Dr. Christine Rodriguez ve Thomas Allison’a hiPSC kültürü konusundaki rehberlikleri için teşekkür eder. Yazarlar ayrıca yayın maliyetlerini karşıladığı için TheWell Bioscience’a teşekkür eder.
Materials
| 24-Well Plate (Culture treated, sterile) | Falcon | 353504 | |
| 37 °C water bath | VWR | ||
| 96-well plate | Fisher Scientific | FB012931 | |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634 | |
| Anti-adherence Rinsing Solutio | STEMCELL Technologies | 7010 | |
| Biological safety cabinet (BSC) | Labconco | Logic | |
| Brightfield Microscope | Echo Rebel | REB-01-E2 | |
| BXS0116 | ATCC | ACS-1030 | |
| Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities) | ThermoScientific | 75002441 | |
| Conical tubes, 15 mL, sterile | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| Conical tubes, 50 mL, sterile | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Cultrex RGF BME, Type 2 | Bio-techne | 3533-005-02 | |
| Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME | Bio-techne | 3434-010-02 | |
| D-PBS (Without Ca++ and Mg++) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor | Gibco | A14133-02 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fischer Scientific | 35050-061 | |
| Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional) | Luminex | 0500-3115 | |
| HEPES buffer solution | Thermo Fischer Scientific | 15630-056 | |
| Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Scientific | 51033775 | |
| JMP Software | SAS Institute | JMP 16 | |
| MATLAB | MathWorks, Inc | R2022b | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free | Corning | 356231 | |
| Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-free | Corning | 354263 | |
| mTeSR Plus Medium | STEMCELL Technologies | 100-0276 | |
| Nunclon Delta surface treated 24-well plate | Thermo Scientific | 144530 | |
| PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM) | BD Pharmingen | 566841 | |
| PE Mouse Anti-human CDX2 | BD Pharmingen | 563428 | |
| PE Mouse Anti-human FOXA2 | BD Pharmingen | 561589 | |
| PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4 | BD Pharmingen | 561565 | |
| ReLeSR | STEMCELL | 5872 | |
| SCTi003-A | STEMCELL Technologies | 200-0510 | |
| Serological pipettes (10 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Serological pipettes (5 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium | STEMCELL Technologies | 5145 | |
| STEMdiff Intestinal Organoid Kit | STEMCELL Technologies | 5140 | |
| Vitrogel Hydrogel Matrix | TheWell Bioscience | VHM01 | |
| VitroGel ORGANOID Discovery Kit | TheWell Bioscience | VHM04-K |
Referanslar
- Hynes, R. O. Integrins: Bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110 (6), 673-687 (2002).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, 4195-4200 (2010).
- Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: Recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biol Rep. 2, 78 (2010).
- Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Rep. 15 (12), 1243-1253 (2014).
- Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: A dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
- Even-Ram, S., Artym, V., Yamada, K. M. Matrix control of stem cell fate. Cell. 126 (4), 645-647 (2006).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Tran, O. N., et al. Organ-specific extracellular matrix directs trans-differentiation of mesenchymal stem cells and formation of salivary gland-like organoids in vivo. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 306 (2022).
- Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
- Gjorevski, N., et al. Tissue geometry drives deterministic organoid patterning. Science. 375 (6576), (2022).
- Heo, J. H., Kang, D., Seo, S. J., Jin, Y. Engineering the extracellular matrix for organoid culture. Int J Stem Cells. 15 (1), 60-69 (2022).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Greenlee, A. R., Kronenwetter-Koepel, T. A., Kaiser, S. J., Liu, K. Comparison of Matrigel and gelatin substrata for feeder-free culture of undifferentiated mouse embryonic stem cells for toxicity testing. Toxicol In Vitro. 19 (3), 389-397 (2005).
- Geltrex LDEV-Free, HESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix User Guide (Pub.No. MAN0007336 3.0. Fisher Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FGeltrex_LDEV_Free_hESC_qualified_PI.pdf (2024)
- biotechne R&D Systems. Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor. biotechne R&D Systems. , (2024).
- VitroGel Organoid Protocol. TheWell Bioscience Available from: https://www.thewellbio.com/video-protocols (2024)
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).
- Henderson, J. K., et al. Preimplantation human embryos and embryonic stem cells show comparable expression of stage-specific embryonic antigens. Stem Cells. 20 (4), 329-337 (2002).
- Haruna, N. F., Huang, J. Investigating the dynamic biophysical properties of a tunable hydrogel for 3D cell culture. J Cytol Tissue Biol. 7, 30 (2020).
- Cherne, M. D., et al. A synthetic hydrogel, VitroGel ORGANOID-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells. Front Pharmacol. 12, 707891 (2021).
- Stewart, D. C., et al. Quantitative assessment of intestinal stiffness and associations with fibrosis in human inflammatory bowel disease. PLoS One. 13, e0200377 (2018).
- Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125 (2020).
- Broguiere, N., et al. Growth of epithelial organoids in a defined hydrogel. Adv Mater. 30, 1801621 (2018).
- Barthes, J., et al. Cell microenvironment engineering and monitoring for tissue engineering and regenerative medicine: The recent advances. BioMed Res Int. 2014, 921905 (2014).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nat Rev Mater. 5 (7), 539-551 (2020).
