Organoidlerde Biyolüminesans Raportörü ile Sirkadiyen Salınımların İzlenmesi
Özet
Çoğu organizmada bulunan sirkadiyen ritimler, biyolojik süreçlerin zamansal organizasyonunu düzenler. 3D organoidler son zamanlarda fizyolojik olarak ilgili bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. Bu protokol, organoidlerde sirkadiyen ritimleri gözlemlemek için biyolüminesan raportörlerin kullanımını açıklar ve çok hücreli sistemlerde sirkadiyen ritimlerin in vitro olarak araştırılmasını sağlar.
Abstract
Çoğu canlı organizma, yaklaşık 24 saatlik bir süre içinde meydana gelen ve uyku-uyanıklık döngülerinden metabolizmaya kadar çeşitli hücresel ve fizyolojik süreçler repertuarını düzenleyen biyolojik süreçler olan sirkadiyen ritimlere sahiptir. Bu saat mekanizması, çevresel değişikliklere dayalı olarak organizmayı sürükler ve moleküler ve fizyolojik olayların zamansal düzenlemesini koordine eder. Daha önce, otonom sirkadiyen ritimlerin, sirkadiyen ritimlerin mekanizmalarını ortaya çıkarmada etkili olan NIH3T3 fibroblastları gibi hücre hatları kullanılarak tek hücre düzeyinde bile korunduğu gösterilmişti. Bununla birlikte, bu hücre hatları, çok hücrelilik ve sağlam hücreler arası iletişimden yoksun homojen kültürlerdir. Son on yılda, in vivo morfolojik yapılara ve işlevlere benzeyen in vitro çok hücreli sistemler olan 3D organoidlerin geliştirilmesi, karakterizasyonu ve uygulanması üzerine kapsamlı çalışmalar yapılmıştır. Bu makale, çok hücreli sistemlerde sirkadiyen ritimlerin in vitro olarak araştırılmasını sağlayan, insan bağırsak enteroidlerinde bir biyolüminesan raportör kullanarak sirkadiyen ritimleri tespit etmek için bir protokolü açıklamaktadır.
Introduction
Sirkadiyen saat
Bakterilerden memelilere kadar tüm organizmaların çevreleri ile karmaşık ve dinamik bir ilişkisi vardır. Bu ilişki içinde, çevresel değişikliklere adaptasyon, organizmaların hayatta kalması için kritik öneme sahiptir. Çoğu organizma, işlevlerini yaklaşık 24 saatlik günlük döngülere adapte etmelerini ve optimize etmelerini sağlayan sirkadiyen ritimlere sahiptir. Sirkadiyen saat, fizyolojik homeostazı korumak ve organizmaları günlük değişikliklerle senkronize tutmak için işbirliği içinde çalışan hiyerarşik bir merkezi ve periferik saatler ağıdır 1,2. Memelilerde, suprakiazmatik çekirdekte (SCN) bulunan merkezi veya ana saat, ışık gibi dış ipuçlarını alır ve bilgileri, nöral ve humoral sinyal yollarının gelişmiş bir etkileşimi yoluyla periferik saatlere iletir3. Merkezi saate ek olarak, periferik dokular, dokuya özgü saat kontrollü genleri (CCG’ler) düzenleyen bir transkripsiyonel-translasyonel negatif geri besleme döngüsü (TTFL) tarafından sürdürülen kendi hücre otonom sirkadiyen saat mekanizmasına sahiptir4,5. Bu moleküler makine, gen ekspresyonları, sinyal yolları, bağışıklık tepkileri ve sindirim gibi hücresel ve fizyolojik olaylarda yaklaşık 24 saatlik ritmiklik üretir. Sirkadiyen saat hemen hemen tüm memeli hücrelerinde bulunur ve genlerin ifade modellerinin %50’ye kadarının sirkadiyen ritmiklik sergilediği gösterilmiştir6. CCG’lerin bolluğu göz önüne alındığında, bu saat mekanizmasının bozulması kritik fizyolojik sorunlara neden olabilir. Bu nedenle, sirkadiyen ritimlerin araştırılması, temel biyolojik mekanizmaları aydınlatmak ve yeni terapötik stratejiler geliştirmek için gereklidir.
Luciferase muhabir sistemi
Sirkadiyen çalışmalarda, gerçek zamanlı izleme, hücresel davranışların ve yanıtların daha iyi anlaşılması için kritik öneme sahiptir, çünkü gen ekspresyonu ve/veya protein seviyelerindeki zamansal değişikliklerin izlenmesine izin verir ve sirkadiyen saat tarafından düzenlenen moleküler mekanizmalar hakkında bilgi sağlar. Ayrıca, gerçek zamanlı izleme, araştırmacıların çevresel değişikliklerin moleküler mekanizmalar üzerindeki etkilerini incelemelerini sağlar 7,8. Zaman içinde gen ekspresyonunu veya protein seviyelerini izlemek için yaygın olarak kullanılan biyolüminesans testi de dahil olmak üzere gerçek zamanlı izleme çalışmaları için çok sayıda teknik vardır. Biyolüminesans testi, ışık üretimini bir okuma olarak kullanarak biyolojik süreçleri tespit etmek için bir yöntemdir. Bu tahlilde, biyolüminesans üreten oksidatif bir enzim (örneğin, lusiferaz) ya geçici ya da stabil bir şekilde ilgilenilen hücrelere transfekte edilir ve biyolüminesans okuması, zaman içinde bir substratın (örneğin, lusiferin) varlığında ölçülür. Örneğin, lusiferaz enzimi, ATP9 varlığında substrat lusiferini oksitleyerek biyolüminesans üretir. Kısa yarı ömrü (3-4 sa10) nedeniyle, ateşböceği lusiferaz, minimum arka plan gürültüsü ile gerçek zamanlı dinamik izleme sağlama açısından sirkadiyen çalışmalar için güçlü bir araçtır 11,12,13. DNA’nın lusiferaz etiketli bir promotör veya açık okuma çerçevesi (ORF) ile eklenmesi için, lentiviral gen dağıtım sistemi, yüksek transdüksiyon etkinliği, stabil entegrasyon ve düşük immünojenisite sağlayan güvenilir bir yöntemdir. Bir biyolüminesan raportörün kararlı transdüksiyonu, bölünen ve bölünmeyen hücrelerde sağlam ifade sağlar ve sirkadiyen çalışmalar için tutarlı veriler üretir14.
Bir model olarak organoid
Geleneksel ölümsüzleştirilmiş iki boyutlu hücre hatları, sirkadiyen ritimlerin temel moleküler mekanizmalarının ortaya çıkarılmasından ilaç taramasına kadar uzanan biyolojik çalışmalarda etkili olmuştur. Homojenize hücre hatlarını kullanmanın rahatlığına rağmen, çok hücreli yapılardan ve hücreler arası etkileşimlerden yoksundurlar. Buna karşılık, organoidler, kök, progenitör ve farklılaşmış hücre tipleri dahil olmak üzere in vivo doku mimarisi ve çok hücrelilik ile benzerlik göstererek bir tabaktaki organ yapısını taklit eden in vitro 3D çok hücreli “organ benzeri” yapılardır15,16. Kendi kendine organizasyon, çok hücrelilik ve işlevsellik özelliklerine sahip olmak, organoidleri gerçek dokularda meydana gelen hücresel ve fizyolojik süreçleri temsil eden dikkate değer bir in vitro model haline getirir17. İnce bağırsak, beyin, karaciğer, akciğer ve böbrek dahil olmak üzere çeşitli organlardan toplanan yetişkin kök hücrelerden yönlendirilmiş farklılaşma yoluyla pluripotent kök hücrelerden farklı organoid türleri türetilebilir18,19. Organoid yapılar gerçek doku benzeri bir mimariye sahip olduklarından, çok hücrelilik ve dinamik hücreden hücreye etkileşim ile işlev gördüklerinden, in vivo dokularda meydana gelen hücresel olayları anlamak için homojenize hücre hatlarına üstündürler. Organoidler ayrıca kolayca manipüle edilebilir ve kontrollü koşullar altında yetiştirilebilir, bu da onları sirkadiyen çalışmalar için faydalı kılar20.
Bu çalışmanın temel amacı, çok hücreli 3D organoidlerde sirkadiyen ritimleri incelemek için özel olarak tasarlanmış bir biyolüminesans testi kullanan gerçek zamanlı bir izleme yöntemini tanıtmaktır. Bir biyolüminesans tahlil tekniği kullanılarak hücresel olayların gerçek zamanlı izlenmesi, gerçek dokularda bulunan çok hücreli karmaşıklık ve hücreler arası iletişimden yoksun hücre kültürleri için yaygın olarak gerçekleştirilmiştir. 3D organoidler, in vitro olarak çok hücreli sistemlerde sirkadiyen ritimlerin işlevlerini araştırmak için eşsiz fırsatlar sunar. Örneğin, değişmiş hücre bileşimleri veya hastaların hastalıklı dokularından türetilen organoidler ile organoidlerdeki sirkadiyen ritimler araştırılabilir. Bu protokol, sirkadiyen ritimlerin farklı yönlerini, periferik organlardaki sirkadiyen ritimlerin rollerini daha iyi anlamamıza yardımcı olacak fizyolojik olarak daha ilgili bir in vitro model olan organoidlerde araştırmak için bir biyolüminesans testinin kullanılmasını sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biyolüminesans testi, uzun süreli zaman kursu deneylerinden veri toplanmasını gerektiren sirkadiyen ritimlerin araştırılması için çeşitli avantajlar sunar. İlk olarak, araştırmacıların, hücreler hareket ettikçe ve çoğaldıkça ilgilenilen gen ekspresyonunu veya proteini izlemelerini sağlar. Gereksiz ayarlamalar yapmadan veya hücrelerin işlevlerini bozmadan, ilgili hücresel olaylar veya gen ekspresyonu, güvenilir gerçek zamanlı veriler sağlayan biyolüminesans okuması kullanılarak kaydedilebi…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
İnsan bağırsak enteroidleri, Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi’ndeki (CCHMC) Dr. Michael Helmrath’ın laboratuvarından elde edildi. Bu çalışma R01 DK11005 (CIH) ve Cincinnati Üniversitesi Kanser Merkezi Pilot Fonu tarafından desteklenmiştir. Cincinnati Üniversitesi Canlı Mikroskopi Çekirdeği’nden (NIH S10OD030402) görüntüleme desteği için minnettarız.
Materials
| 35 x 10 Falcon tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772A | |
| A 83-01 | Sigma Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-028 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| BD Micro-Fine IV Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-829-1Bb | Mfrn: BD 329424 |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | GSK-3 inhibitor |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902-500MG | |
| D-Luciferin (potassium salt) | Cayman Chemical | 14681 | |
| Gastrin I Human | Sigma Aldrich | G9020 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Growth Factor reduced (GFR) Matrigel | Corning | CB-40230C | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stemcell Technologies | 06010 | Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium |
| Kronos Dio Luminometer Machine | ATTO Corporation | AB-2550 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| pABpuro-BluF reporter plasmid | Addgene | 46824 | |
| PBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant murine EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Y-27632 | R&D Systems | 1254/10 | ROCK inhibitor |
Referanslar
- Cox, K. H., Takahashi, J. S. Circadian clock genes and the transcriptional architecture of the clock mechanism. J Mol Endocrinol. 63 (4), R93-R102 (2019).
- Ayyar, V. S., Sukumaran, S. Circadian rhythms: Influence on physiology, pharmacology, and therapeutic interventions. J Pharmacokinet Pharmacodyn. 48 (3), 321-338 (2021).
- Reppert, S., Weaver, D. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
- Takahashi, J. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. 18 (3), 164-179 (2017).
- Wolff, C. A., et al. Defining the age-dependent and tissue-specific circadian transcriptome in male mice. Cell Rep. 42 (1), 111982 (2023).
- Ruben, M. D., et al. A database of tissue-specific rhythmically expressed human genes has potential applications in circadian medicine. Science Trans Med. 10 (458), 8806 (2018).
- Huang, S., Lu, Q., Choi, M. H., Zhang, X., Kim, J. Y. Applying real-time monitoring of circadian oscillations in adult mouse brain slices to study communications between brain regions. STAR Protoc. 2 (2), 100416 (2021).
- Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnol. 10 (3), (2010).
- Choy, G., et al. Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging. Biotechniques. 35 (5), 1022-1030 (2003).
- Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29 (3), 590-598 (2000).
- Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters. J Vis Exp. (67), e4234 (2012).
- Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).
- Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).
- Lee, S., Hong, C. I. Organoids as model systems to investigate circadian clock-related diseases and treatments. Front Genet. 13, 874288 (2022).
- Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. J Mol Med. 95 (7), 729-738 (2017).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Rosselot, A. E., et al. Ontogeny and function of the circadian clock in intestinal organoids. EMBO J. 41 (2), 106973 (2021).
- Corrò, C., Novellasdemut, L., Li, V. S. W. A brief history of organoids. Am J Physiol Cell Physiol. 319 (1), C151-C165 (2020).
- Brown, S. A., et al. The period length of fibroblast circadian gene expression varies widely among human individuals. PLos Biol. 3 (10), e338 (2005).
- Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L. M., Montenegro-Miranda, P. S., Vanden Brink, G. R., Heijmans, J. A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids. J Vis Exp. (98), e52531 (2015).
- Criss, Z. K., et al. Drivers of transcriptional variance in human intestinal epithelial organoids. Physiol Genomics. 53 (11), 486-508 (2021).
- Izumo, M., Sato, T. R., Straume, M., Johnson, C. H. Quantitative analyses of circadian gene expression in mammalian cell cultures. PLoS Comput Biol. 2 (10), e136 (2006).
- Hara-Miyauchi, C., et al. Bioluminescent system for dynamic imaging of cell and animal behavior. Biochem Biophys Res Commun. 419 (2), 188-193 (2012).
- Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).
- Xu, P., Elizalde, M., Masclee, A., Pierik, M., Jonkers, D. Corticosteroid enhances epithelial barrier function in intestinal organoids derived from patients with Chron’s disease. J Mol Med (Berl). 99 (6), 805-815 (2021).
- AlMusawi, S., Ahmed, M., Nateri, A. S. Understanding cell-cell communication and signaling in the colorectal cancer microenvironment. Clin Transll Med. 11 (2), 308 (2021).
