Bakteriyel Klerensi Ölçerek Caenorhabditis elegans'ta Gıda Alımının Ölçülmesi

Caenorhabditis elegans, yaşlanma araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır.  Diyet kısıtlaması, azalmış mitokondriyal aktivite veya azalmış insülin sinyalizasyonunun neden olduğu metabolizma aracılı uzun ömürlülüğün altında yatan genetiği incelemek için güçlü bir model olmuştur. 1,2,3,4,5,6,7. Bununla birlikte, hayvanın küçük boyutu nedeniyle C. elegans için uzun ömürlülük bağlamında beslenmenin ölçülmesinin zor olduğu kanıtlanmıştır ^{3,8,9,10,11,12,13,14,15}.

Beslenme, hayatta kalmak için gerekli olan temel bir biyolojik davranıştır ve sıkı düzenlemesi, metabolik sağlığın, üremenin ve yaşlanmanın sürdürülmesinin merkezinde yer alır. Beslenme davranışı, hem sinir sisteminde hem de çevrede çoklu sinyal yolları tarafından kontrol edilir ve bu nedenle yalnızca in vivo olarak incelenebilir 16,17,18,19. Beslenme, üç sütundan ilkini temsil eder: (i) enerji alımı, (ii) enerji depolama ve (iii) bir organizmanın enerji homeostazını yöneten enerji harcaması. C. elegans'ta beslenme, esas olarak, farenksin kasılma hızı ile tanımlandığı gibi, faringeal pompalamanın ölçülmesiyle araştırılmıştır. Bu yaklaşım, C. elegans'ın beslenme davranışı 3,4,8,12,13,20,21; Bununla birlikte, özellikle kısa dakika aralıklarında ölçülen faringeal pompalama, mutlaka gıda alımı ile ilişkili değildir.

Gıda alımı sadece faringeal pompalama hızı ile değil, aynı zamanda beslenme nöbetlerinin süresi ve sıklığı ve gıda bakterilerinin yoğunluğu gibi parametreler tarafından da belirlenir. Bir hayvan çok yüksek bir faringeal pompalamaya sahip olabilir, ancak beslenme nöbetlerinin uzunluğu daha kısa olabilir ve bu da artan oranı dengeler. Diğer bir kafa karıştırıcı faktör, pompalamanın bakterileri yutabileceği veya yutamayacağı veya öğütemeyeceği verimliliktir. Gıda alımının faringeal pompalamadan ayrılmasının aşırı bir örneği, herhangi bir gıda (bakteri) bulunmadan serotonin ilavesidir. Eksojen serotonin varlığında, hayvanlar yüksek oranda pompalanır, ancak bakteri olmadan, yüksek pompalama hızı gıda alımına yol açmaz 2,6,13,22,23.

Burada sunulan bakteri temizleme yöntemi, zaman içinde bakteri konsantrasyonlarının azalması olarak tek tek kuyucuklardaki solucan popülasyonlarının gıda alımını ölçer (Şekil 1). Bu yaklaşım, gıdanın ortadan kaybolmasının gıda alımının bir ölçüsünü temsil ettiği diğer türlerde kullanılanlara benzer 10,11,24,25,26,27,28. Orijinal yayında, C. elegans'ı ¹⁵N izotop etiketli bakteri¹¹ ile besleyerek gıda alımını ölçmek için bu yöntemi doğruladık. Kütle spektrometresi ile yapılan müteakip ölçümler, bakterilerin yok oluşunun ölçülmesinin, izotop etiketlemesinin oluşumu ile güçlü bir şekilde ilişkili olduğunu ve bakterilerin hayvana gerçek alımını ortaya çıkardığını gösterdi¹¹. Bu nedenle, bakteri temizleme testinin çoğu durumda gıda alımını temsil ettiğinden eminiz. Testin amacı, faringeal pompalama testinin yerini almak değil, C. elegans'ta beslenme ve metabolizmayı ve bunun yaşlanma ve uzun ömür ile nasıl ilişkili olduğunu incelemek için tahlillerin araç kutusuna eklemektir.

Şekil 1: Bakteriyel klirens testinin şeması. Protokolün ana bölümlerinin grafiksel taslağı (Yukarıdan aşağıya): Bakterilerin hazırlanması, solucan popülasyonunun senkronize edilmesi, 96 oyuklu plakalarda tohumlama, solucanların sterilize edilmesi, ilaç eklenmesi, 1. ve 4. günlerde OD_600'ün ölçülmesi. Bu belirli adımların ayrıntılı bir açıklaması, her tasvirin solunda belirtilmiştir. Kısaltmalar: OD = optik yoğunluk; FUdR = florodeoksiüridin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Bakteri hazırlama

NOT: Bu bölüm, bu tahlilde kullanılan besleme bakterilerinin hazırlanmasını detaylandırır. Testte kullanılan spesifik E. coli suşu OP50 olarak adlandırılır. OP50, C. elegans'ı beslemek için en yaygın kullanılan türdür. Kullanılan OP50 suşu, solucan kültürünün diğer bakterilerle çapraz kontaminasyonunu önleyen Karbenisilin/Ampisilin'e dirençlidir⁹.

1. OP50'yi 4-5 gün önceden hazırlayın ve kullanımdan bir gün önce röntgen ışınlayın. OP50 ile karşılaşan tüm malzemelerin steril olduğundan emin olun^29,30.
2. Gün -8: Çarşamba (1. hafta):
   1. 5 mL LB'yi 100 μg/mL Ampisilin ve 0.1 μg/mL Amfoterisin B ve tek bir OP50 kolonisi ile aşılayarak preinokülumu hazırlayın ve bir bakteri çalkalayıcıda 37 ° C'de yaklaşık 6 saat inkübe edin. Kültürün bulanıklaşması için yeterli büyümeye izin vermek için erken aşılayın.
   2. Kültür bulanıklaştığında, OP50'nin preinokülum kültürünü 100 μg / mL Ampisilin içeren 250 mL TB içinde 1: 2.000 oranında seyreltin. Kültürü gece boyunca bir bakteri çalkalayıcıda 37 ° C'de 17-19 saat inkübe edin.
      NOT: Kültürün 19 saatten daha uzun süre büyümesine izin verilmemelidir.
3. Gün -7: Perşembe (1. hafta)
   1. 17-19 saatlik inkübasyondan sonra, OP50 sıvı kültürünü steril bir santrifüj tüpüne aktarın ve 4 ° C'de bir masa üstü santrifüjde 3.100 × g'da 15 dakika santrifüjleyin.
   2. Süpernatanı atın, OP50 peletini steril suyla yeniden süspanse edin ve yeniden santrifüjleyin. Bu yıkamayı 2 kez tekrarlayın.
   3. İkinci yıkamadan sonra, süpernatanı atın, OP50 peletini steril suda 50 mL'lik bir hacme kadar yeniden süspanse edin ve önceden tartılmış 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın. OP50'yi 4 °C'de bir masa üstü santrifüjde 3.100 × g'da 20 dakika santrifüjleyerek peletleyin.
   4. Üçüncü yıkamadan sonra, kalan tüm süpernatanı dikkatlice çıkarın ve tüpte su kalmadığından emin olun. Boş santrifüj tüpünün ağırlığını pelet ile santrifüjleme tüpünün ağırlığından çıkararak peletin ağırlığını hesaplayın.
      NOT: Pelet ağırlıkları tipik olarak 3-3,5 g arasında değişir.
   5. OP50 peletini S-tam tampon içinde 100 mg / mL'lik bir konsantrasyona iyice yeniden süspanse edin ve topak olmadığından emin olun.
   6. 100 mg / mL'deki OP50 konsantrasyonunun 2 × 10¹⁰ bakteri / mL'ye karşılık geldiğinden emin olun. Optik yoğunluk ile mL başına bakteri sayısı arasındaki ilişki biliniyorsa, mL başına bakteri konsantrasyonunu spektrofotometrik olarak belirleyin. Gerekirse, OP50 besleme çözeltisinin konsantrasyonunu 2 × 10¹⁰ bakteri / mL'ye ayarlamak için S-tam tampon kullanın.
   7. Kontamine olup olmadığını belirlemek için OP50'yi bir agar plakası üzerinde test edin.
   8. OP50'yi 4 °C'de S-tam tamponda asılı olarak saklayın.

4. Gün -3: Pazartesi (2. hafta)
   1. Test sırasında bakteri üremesini önlemek için bakterileri X-ışını ışınlaması yoluyla öldürün.

2. Senkron solucan kültürü hazırlama

NOT: Bu bölümde, senkron bir solucan popülasyonunun hazırlanması anlatılmaktadır. Solucan popülasyonları ile temas eden tüm materyaller sterildir. Aksi belirtilmedikçe tüm plakalar 20 °C'de tutulur.

1. Gün -6: Cuma (1. hafta), 16:00
   1. Hayvanları taze bir tabağa aktarın.
      1. Solucan popülasyonunun çoğunun aç L1 larvalarından oluştuğu bir NGM plakası alın.
         NOT: Karışık bir popülasyon da sonuç verecektir. Uzun süre aç bırakılan L1 solucanlarının kullanılması, mevcut veya gelecek nesillerdeki beslenme davranışını etkileyebilir, çünkü açlık en az üç nesil boyunca epigenetik izler bırakabilir.
      2. Solucanları 1 mL'den fazla steril su ile yıkayın. Yıkanmış solucan popülasyonunun ~ 300 μL'sini konsantre OP50 (~ 300 mg / mL) ile tohumlanmış NGM plakalarına alıkoyun. Plakaların bir plaka kurutucu veya bir Bunsen brülörü altında kurumasına izin verin. Plakaları 20 ° C'de, popülasyonun çoğu gravid yetişkinleri içerene kadar (Pazartesi) kuluçkaya yatırın.
         NOT: Bu zaman dilimi, vahşi tip bir N2 solucan popülasyonu için optimize edilmiştir ve suştan türe değişebilir. Gelişme gecikmeleri olan solucanlar dikkate alınmalı ve daha erken parçalanmalı ve/veya daha erken tohumlanmalıdır, böylece test edilen tüm suşlar aynı anda yetişkinliğe ulaşacaktır.
2. Gün -3: Pazartesi (2. hafta) 10:00
   1. Eşzamanlı bir popülasyon oluşturma
      DİKKAT! Çamaşır suyu cilt ve gözler için aşındırıcıdır. Kullanımı eldiven ve koruyucu gözlük gerektirir.
      1. Solucanları plakadan 10 mL'ye kadar steril su ile yıkayarak toplayın. Bu solucan / su çözeltisini 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
      2. Solucanları yaklaşık 4 dakika boyunca tezgah üstünde yerçekimi lavabosu ile yıkayın (tersine, 310 × g'da bir masa üstü santrifüjde 2 dakika santrifüjle yıkayın.
      3. Süpernatanı küçük bir uç kullanarak aspirasyon yoluyla atın ve 15 mL'ye kadar steril su ekleyin. 3x tekrarlayın.
      4. Süpernatanı çıkarın ve 5 mL taze hazırlanmış çamaşır suyu / NaOH çözeltisi (1.8 mL ev tipi çamaşır suyu, 0.5 mL 10 N NaOH, 7.7 mL dH₂O) ekleyin.
      5. Oda sıcaklığında veya solucanlar açılana kadar 5 dakika inkübe edin. En az 10 saniye boyunca her dakika nazikçe girdap yapın. Diseksiyon mikroskobu altında ilerlemeyi izleyin.
         NOT: Solucanları kırmak için gereken süre suştan suşa değişebilir. Solucanları çamaşır suyu solüsyonunda çok uzun süre bırakmak, cansız yumurtalara neden olabilir.
      6. Tüm yetişkinler açıldığında veya çözündüğünde (son hacim 15 mL olacak) reaksiyonu nötralize etmek için M9 tamponu ekleyin ve 1.300 × g'da 2 dakika santrifüjleyin.
      7. Yumurtaları 3 kez 13 mL M9 tamponu ile yıkayın.
      8. Yumurtaları 1.300 × g'da 2 dakika santrifüj ederek 10 mL S-tam tampon ile bir kez yıkayın.
      9. Süpernatanı aspire edin, 10 mL S-complete ekleyin ve süspansiyonu 15 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın. Tüpü gece boyunca bir nutatör veya benzeri bir cihaz üzerinde oda sıcaklığında yavaşça döndürün.
      10. İsteğe bağlı: S-tam tamponda son santrifüjlemeden sonra yetişkin karkaslar mevcutsa, solucan çözeltisini 40 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
3. Gün -2: Salı (2. hafta), 13:00
   1. Hayvanları tabaklara tohumlamak
      1. Bir diseksiyon kapsamı kullanarak, solucanların yumurtadan çıkıp çıkmadığını kontrol edin. Bir diseksiyon kapsamı kullanarak solucan popülasyonunu 10 μL'lik damlalar halinde sayarak S-tam tamponundaki solucan konsantrasyonunu belirleyin; Her numune için 5-10 damla sayın. Her 10 μL'lik damladaki solucan konsantrasyonu damla başına 30 solucanı aşarsa, saymayı kolaylaştırmak için toplam stoğu S-complete ile damla başına daha düşük bir solucan yoğunluğuna seyreltin.
      2. Sıvı solucan karışımını, 120 μL'lik bir hacimde 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna aşağıdaki gibi tohumlayın (nihai konsantrasyonlar): S-tam içinde 60 solucan / mL, 50 μg / mL Karbenisilin, 0.1 μg / mL Amfoterisin ve 6 mg / mL OP50 bölüm 1'de hazırlanan.
         NOT: Hazırlanacak toplam hacim plaka sayısına bağlıdır (96 oyuklu plaka başına ~ 12 mL). Her oyukta 6-12 solucan bulunmalıdır. Alternatif olarak, Union Biometrica'nın COPAS FP'si gibi büyük bir partikül akış sitometrisi, her bir kuyucuğa 10 solucanı hassas bir şekilde ayırmak için kullanılabilir (Bkz. kalabalık etkisi bölümü).
      3. Ayrıca solucan içermeyen bir sıvı karışımı da içerir: 50 μg/mL Karbenisilin, 0.1 μg/mL Amfoterisin ve 6 mg/mL OP50 bölüm 1'de hazırlanır.
      4. Daha önce de belirtildiği gibi, kendi kendine değerlerini belirlemek için kullanılan 96 oyuklu plakanın H sırasına 120 μL solucansız karışım koyun. AG sıralarında solucanlar ile karışımın oyuğuna 120 μL koyun.
         NOT: Pipetleme sırasında solucanların süspansiyon halinde tutulduğundan emin olun (bkz. Şekil 2A, B). Düz tabanlı şeffaf 96 oyuklu plakalar kullanıyoruz. Plaka düzenimiz, her bir sütun çiftinin farklı bir ilaç tedavisi veya solucan suşu olacağı ve alt sıranın "solucan yok" kontrolü olarak hizmet edeceği 4 veya 6 koşul üretmek için plakayı böler (Şekil 2A, B).
      5. Kirlenmeyi ve buharlaşmayı önlemek için plakayı bir bant kapatıcı ile kapatın. Plakaları, hayvanlar L4 solucanı haline gelene kadar 20 ° C'de yaklaşık 65 saat kuluçkaya yatırın.
4. 0. Gün: Perşembe (2. hafta) öğleden önce.
   1. Florodeoksiüridin (FUdR) ilavesiyle solucan popülasyonunun sterilizasyonu.
      1. Her oyuktaki hayvanları sterilize etmek için 30 μL 0.6 mM FUdR stok çözeltisi ekleyin. Bant kapatıcılar kullanarak plakayı yeniden kapatın ve plakaları 800 rpm'de bir mikro titre plaka çalkalayıcı üzerinde 20 dakika sallayın. Plakaları 20 °C inkübatöre geri koyun.
         NOT: Bu adımda, nihai OP50 konsantrasyonu 6 mg / mL'den 5 mg / mL'ye (1 × 10⁹ bakteri / mL) düşürülür ve her bir kuyucuğun nihai hacmi 150 μL'dir. Hayvanlar yetişkinliğe ulaşmadan önce FUdR'yi L4 aşamasına eklemek çok önemlidir.
5. 1. Gün: Cuma (2. hafta)
   1. Kültüre ilaç ekleyin.
      1. Sabah 9:00'a kadar, çoğu hayvanın gravid olduğunu ve her oyuğun birkaç yumurta içerdiğini onaylayın. Gerekirse, istenen konsantrasyona herhangi bir ilaç ekleyin (tartışmaya bakın).
      2. İlacı ekledikten sonra, plakaları bant kapatıcı ile kapatın ve plakaları bir plaka çalkalayıcı üzerinde 800 rpm'de 20 dakika çalkalayın.
         NOT: Çalkalama, tüm bakteri kümelerinin sızdırmazlık maddesine dokunmadan çözülmesini sağlar. Sızdırmazlık maddesi üzerindeki hem bakteri kümeleri hem de sıvı OD₆₀₀ okumasını bozacaktır. Sızdırmazlık maddesinin üzerinde sıvı damlaları varsa, 310 × g'da 10-20 saniye kısaca döndürün. Çalkalayıcı üzerinde tekrar 5 dakika çalkalayın ve ölçün.
      3. Mikrotitre plaka çalkalayıcı üzerinde 20 dakika çalkaladıktan sonra, kapağı ve contayı çıkarın ve OD_600'ü bir plaka okuyucuda ölçün; bu, Gün 1 OD₆₀₀ ölçümüdür. Plakaları kapatın ve 20 °C'lik bir inkübatöre geri koyun.
         NOT: Bakteriler hızlı bir şekilde yerleştiğinden, okuma plakaları salladıktan sonra 10 dakika içinde yapılmalıdır.
      4. Bir ilaç eklenmişse, solucan popülasyonunu kontaminasyon veya toksisite belirtileri açısından kontrol etmek için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın. Plakaları 20 °C inkübatöre geri koyun.
6. 4. Gün: Pazartesi (3. hafta)
   1. Gün 4 OD₆₀₀ okumasını alın.
      1. Gün 1 OD 2.5.1.3 değerini elde etmek için 4 . günden (₆₀₀ . adım) itibaren okuma prosedürünü tekrarlayın. OD₆₀₀ ölçümünden önce, plakaları mikrotitre plaka çalkalayıcı üzerinde 800 rpm'de 20 dakika çalkalayın.
      2. Ters çevrilmiş bir mikroskopta, ideal olarak 2x objektifle, her bir oyuktaki solucan popülasyonunu sayın ve bir elektronik tabloya kaydedin. Plakaları saydıktan sonra 20 °C inkübatöre geri koyun.
         NOT: Ek Materyal'de sağlanan puanlama sayfamızın bir örneğine bakın.
      3. 4. Gün okumasından sonra, gıda alımı ölçümleri tamamlanır. Gerekirse, bu plakaları kullanım ömrü analizi için saklayın.
         NOT: Bu protokol Solis ve Petrascheck³¹ ile uyumludur.

3. Gıda alım verilerinin analizi

Şekil 2: Tasarım ve analiz. (A, B) H satırında "solucansız" kontrol kuyuları ile 4 ve 6 koşulları için olası plaka tasarımları. Bu kuyular kendi kendine analiz oranını belirlemek için gereklidir. Her plakada, referans olarak her zaman bir N2 işlenmemiş kontrol popülasyonu ekleyin. (C) Sağlanan elektronik tabloda solucan sayısı (yeşil kutu), 1. ve 4. günlerdeki iki OD₆₀₀ ölçümü (turuncu kutular), kendi kendine analiz değerleri (mavi kutu) ve kırmızı kutuda formül (2) ((OD₆₀₀ -kendi kendine analiz)/X0) kullanılarak yapılan değerlendirme ile toplanan örnek veriler. Burada gösterilen özel örnek, (B)'de gösterilen plaka tasarımını kullanır. Kısaltmalar: OD = optik yoğunluk; X0 = kuyucuk başına solucan sayısı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

NOT: Bu bölüm, bu protokolün 2. bölümündeki gıda alımı verilerinin nasıl analiz edildiğini açıklamaktadır. Hesaplanacak ilk değerler kendi kendine kontrol değerleridir. Bakteriler, solucanların yokluğunda bile zamanla sıvı içinde parçalanır. Bu selflysis değeri de birçok kimyasaldan etkilenebilir ve bir solucanın besin alımına kıyasla nispeten büyük olduğu için kontrol edilmesi gerekir. Adım 2.3.1.4'te açıklandığı ve Şekil 2A, B'deki plaka düzeninde gösterildiği gibi, H satırı solucanlar hariç aynı çözeltiyi içerir. Şekil 2B'de gösterilen plaka kurulumumuzda, iki ilgili kendi kendine kontrol kuyusu ile koşul başına 14 kuyu vardır (satır H, "solucan yok").

1. Denklem (1) kullanarak her koşulda solucansız kontrol kuyuları için kendi kendine kontrol değerlerini hesaplayın. Her bir çoğaltma kuyusu grubu için, adım 2.3.1.4'te belirtildiği gibi en az iki solucansız kontrol kuyusu olduğundan emin olun. Bir çoğaltma grubu için özanaliz değeri için tüm solucansız kontrol kuyularından gelen ortalamayı kullanın.
   Selfysis = ortalama(OD6₀₀ Gün 1 - OD6₀₀ Gün 4) (1)
   NOT: Şekil 2B'de gösterilen plaka kurulumu için, H satırındaki iki kendi kendine kontrol kuyusunun ortalamasını hesaplayarak, altı grubun her biri için bir tane olmak üzere altı özsellik değerini hesaplayacağız.
2. Denklemi kullanarak solucan başına gıda alımını hesaplayın
        (2).
   NOT: Elektronik tabloda kullanılan formül (kırmızı kutu, Şekil 2C) ve X0 kuyucuk başına solucan sayısıdır.
3. Her kuyucuk için solucan başına gıda alımı belirlendikten sonra, tüm durum için ortalamaları ve standart sapmayı hesaplayın.
   NOT: Şekil 2B'de gösterilen plaka kurulumu için, istatistiksel karşılaştırmalar için koşul başına 14 çoğaltma kuyusu yeterlidir.
4. Her koşulu ilgili N2 işlenmemiş kontrol popülasyonuna normalleştirin. Beslemedeki değişikliği kat değişikliği veya N2 beslemesinin yüzdesi olarak belirtin.
   NOT: Denklem (2)'deki OD6₀₀/X0'ın mutlak değerleri farklı günlerde yapılan deneyler arasında farklılık gösterebileceğinden normalleştirme yapılır.

Şekil 3: Temsili veriler. (A) Grafik, serotonin konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak gıda alımındaki kıvrım değişiminin doz-yanıt eğrilerini göstermektedir. Tüm veriler, N2 bazal beslenmeye normalize edilmiş uyarılmamış bazal gıda alımını göstermektedir. Daf-16 (mu86) hayvanlarının, serotonin eklenmediğinde vahşi tip N2'den daha fazla yediğini, ancak beslenmeyi kontrol etme yeteneklerinde körelmiş bir aralık gösterdiğini unutmayın. (B) Grafik, 50 μM antipsikotik Loxapine ile tedavi edilen ancak X-ışınları, γ-ışınları veya paraformaldehit tarafından öldürülen bakterilerle beslenen solucanların gıda alımındaki kıvrım değişiminin bir keman grafiğini göstermektedir (C) Grafik, x ekseninde belirtilen genotipleri ile farklı mutantların gıda alımındaki kıvrım değişiminin bir keman grafiğini göstermektedir. Bu veriler, exc-4 ve cgr-1 mutantlarının daha az yediğini, srp-6 mutantlarının ise daha fazla yediğini göstermektedir. Yıldız işaretleri, ANOVA ve Brown-Forsythe-Welch tarafından belirlendiği üzere ** p < 0.001, ****p < 0.0001'i temsil eder, çoklu hipotez testini hesaba katmak için post-hoc düzeltilmiştir. Hata Çubukları ±S.E.M. gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 1, bu protokolün genel iş akışını vurgulamaktadır. Bakterilerin yapımından 1. ve 4. günlerde OD600 okumasının elde edilmesine kadar tüm süreci göstermektedir. Ek olarak, infografik, kullanılan yöntemlerin belirli adımlarına atıfta bulunur. Şekil 2A, B, tartışma bölümünde açıklanan kendi kendine analiz oranlarını hesaplamak için gerekli olan H sırasındaki "solucansız" kontrol kuyuları da dahil olmak üzere iki olası deneysel plaka düzenini göstermektedir. Laboratuvarımızın deneyimlerine göre, deneyler arasında gözlemlenen solucanların bakteri alımının değişkenliğini hesaba katmak için tedavi edilmemiş N2 kontrolünün koşullarından biri için gereklidir (tartışmaya bakınız: Planlama [N2 referans popülasyonu]).

Şekil 2C, bu protokolde oluşturulan verileri analiz etmek için kullanılan elektronik tablonun bir örneğidir. Yeşil renkte solucan sayısını, mavi renkte bencillik , turuncu renkte 1. gün OD600 ve 4. gün OD600'ü ve kırmızı renkte solucan başına gıda alımını vurgular. Ek olarak, her kuyucuk suş, ilaç, konsantrasyon, deney tarihi ve eklenen diğer tedaviler için izlenir. Kullanılan spesifik denklemler hakkında daha fazla bilgi protokol bölüm 3'te bulunabilir. Genel olarak, bu elektronik tablolar (Ek Materyaller olarak sağlanan şablon), bu protokolün verimli bir şekilde veri toplanmasını ve analiz edilmesini sağlar.

Şekil 3A , bu protokolü kullanarak serotoninin N2 ve daf-16 mutantlarında beslenmeyi nasıl modüle ettiğine dair bir doz-yanıt eğrisi için temsili sonuçları göstermektedir. Bu deneyde, bazal gıda alımından (eğrideki ilk nokta) kat değişimi, artan beş serotonin dozu boyunca hesaplandı. Bu sonuçların vurguladığı gibi, N2 suşu doza bağlı bir şekilde aşırı yemek yiyebilir. Bununla birlikte, daf-16 (mu86) mutantı için, bazal besleme N2'den daha yüksek olmasına rağmen, mutant, N2 suşu ile aynı doza bağlı şekilde serotonine yanıt veremez. Bu protokol, doz-yanıt eğrileri oluşturmak için serotonin konsantrasyonunun değişken faktör olduğu iki suş arasındaki beslenme davranışını belirlememizi sağlar. Şekil 3B , antipsikotik Loxapine ile tedavi edilen ancak X-ışınları, γ-ışınları veya paraformaldehit tarafından öldürülen bakterilerle beslenen solucanların gıda alımını göstermektedir. Bu deneylerin paralel olarak yürütülmediğini ve farklılıkların bakterileri öldürmek için farklı yöntemleri temsil etmediğini, ancak deneyler arası değişkenlikten kaynaklandığını unutmayın. Şekil 3C , bir dizi genetik suşun gıda alımını göstermektedir, iki suş bir azalma ve bir suş N2'ye göre beslenme davranışında bir artış göstermektedir. Protokolün bu uygulaması, bir ilacın farklı genetik arka planlarda bir konsantrasyonda test edilmesini sağlar. Aynı ilaç verildiğinde vahşi tip N2 kontrollerinden farklı bir gıda alımı yanıtı gösteren genetik geçmişleri tanımlamak için uygundur. Aynı tabak kurulumunda gıda alımını ve kullanım ömrünü hızlı bir şekilde taramak için kullanım ömrü protokolümüzle eşleştirilebilir31.

Ek Materyal: Şekil 2C'de gösterilen elektronik tablo şablonları. Bu materyalleri indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.