Primer İnsan Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Meme kanseri, tüm dünyada kadınlarda teşhis edilen birincil kanser türüdür ve kanserden ölümlerin birincil nedenidir¹. Meme kanserinin patogenezi karmaşıktır ve genetik, çevre ve yaşam tarzı gibi birçok faktörü içerir. Aktif süt üreten hücreler olan HMEC'ler, meme dokusunun en önemli bileşenlerinden biridir ve muhtemelen meme kanseri karsinogenezinde yer alan orijinal hücrelerdir. Bu nedenle, HMEC'ler meme kanseri çalışması için araştırmacılardan en fazla ilgiyi görmüştür². Ayrıca, birincil hücreler, genetik stabiliteyi, normal morfolojiyi ve ölümsüzleştirilmiş hücre dizileri ile elde edilemeyen daha eksiksiz bir temel hücresel işlevler setini korumaları nedeniyle karmaşık hücresel süreçlerin biyolojik olarak ilgili bir karakterizasyonunu sağlama yeteneğine sahiptir³. Bu nedenle, primer HMEC'lerin izolasyonu ve kültürü, meme kanseri ve meme inflamatuar hastalıkları gibi meme ile ilgili hastalıkların çoğunun incelenmesi için önemli bir adımdır.

Şu anda, sıçanlardan,, domuzlardan ve keçilerden meme epitel hücrelerinin izolasyonu, kültürü ve tanımlanması için kararlı ve tekrarlanabilir bir sistem kurulmuştur 4,5,6,7. Bununla birlikte, birincil HMEC'lerin izolasyonu ve kültürü, karmaşık mikro çevre ve düşük hücre verimi nedeniyle zordur. Onlarca yıldır bilim adamları, HMEC'ler için bir kültür sistemi yaklaşık 20 yıl önce kurulmuş olmasına rağmen, HMEC'leri izole etmek ve yetiştirmek için en etkili yöntemi arıyorlar. Örneğin, Hammond ve ark. HMEC'lerin verimli bir şekilde büyüdüğü serum içermeyen bir kültür ortamı geliştirdi⁸. Son zamanlarda, Zubeldia-Plazaola ve ark. HMEC'leri elde etmek için sıralı filtrasyon veya diferansiyel santrifüjleme adımları ile birlikte hızlı/yavaş enzim sindirim prosedürlerini kullanarak dört farklı izolasyon yöntemini test etti⁹. Diferansiyel santrifüjleme ile birlikte yavaş sindirim yönteminin, HMEC'leri taze meme dokusundan izole etmek için en etkili yöntem olduğunu buldular. Bununla birlikte, bu izolasyon yöntemi büyük doku parçaları (40-75 g) gerektirir ve daha büyük miktarlarda sindirim enzimleri kullanır. Prosedürleri karmaşıktır (farklı hücre fraksiyonları elde etmek için en az üç farklı santrifüjleme) ve zaman alıcıdır. Bu nedenle, araştırma ve klinik uygulamalar için küçük miktarlarda meme dokusundan HMEC popülasyonlarını verimli bir şekilde elde etmek için hala basit ve hızlı bir yönteme ihtiyaç vardır⁹.

Önceki çalışmalarımız, Rho ile ilişkili kinaz (ROCK) inhibitörü Y-27632'nin ilk kültür ortamına eklenmesinin, diş eti epitel hücrelerinin¹¹ izolasyonu için de başarıyla kullanılan insan derisi epidermal hücrelerinin¹⁰ izole edilmesi sürecini basitleştirebileceğini göstermiştir. Ek olarak, Zubeldia-Plazaola'nın grubu ve Jin'in grubu tarafından yürütülen daha önceki araştırmalar, Y-27632'nin meme dokusundan^türetilen primer epitel hücrelerinin hızlı ve sınırsız in vitro büyümesini uyarma yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir ^9,12. Bu çalışma, Y-27632 kullanımının HMEC'lerin izolasyonunu ve kültürünü basitleştirip basitleştirmeyeceğini test etmeyi amaçladı ve HMEC'leri küçük meme dokusu parçalarından (1 g) izole etmek için basit ve kolay uygulanabilir bir yöntemi başarıyla oluşturduk.

Bu protokolde kullanılan taze normal meme dokuları, Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi'nde, Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi Tıbbi Etik Komitesi'nin yönergelerine göre refrakter granülomatöz lobüler mastit lezyonu etrafındaki cerrahiden toplanır (Protokol No. ChiMCTR2100005281, Tarih: 2017-07-17).

1. Doku edinimi

1. Yetişkin kadınlardan alınan cerrahi örneklerden taze meme dokularını% 3 penisilin / streptomisin (P / S) içeren 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içeren steril tüplere toplayın.
   NOT: Meme dokuları, ameliyattan alındıktan sonraki 24 saat içinde aşağıdaki ayrıntılara göre ele alınmalıdır.

2. Dokunun ön tedavisi

1. Yağ dokusunu meme dokusundan iki çift forseps ile çıkarın ve kalan meme dokusunun ~1 g ağırlığında olduğundan emin olun.
2. Meme dokusunu 5 saniye boyunca% 75 etanol çözeltisinde (5 mL) durulayın ve ardından 20 mL yıkama çözeltisi (Tablo 1) ile 2 x 5 dakika yıkayın.

3. Dokunun sindirimi

1. Meme dokusunu daha küçük parçalara bölün ve doku homojenatını elde etmek için 15 dakikalık bir süre boyunca iki cerrahi bıçak kullanarak dokuyu parçalayın. Doku parçalarını 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
2. Meme dokusu parçalarını içeren 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplam 20 mL sindirim solüsyonuna 10 mL 5.0 mg / mL dispas + 5.0 mg / mL kollajenaz solüsyonu, 3 mL %0.25 tripsin ve 7 mL PBS ekleyin. Tüpü 37 ° C'de bir su banyosuna yerleştirin ve 1,5 saat inkübe edin; Tüpü her 20 dakikada bir çalkalayın.
3. 20 mL nötralize edici solüsyon enjekte ederek sindirim işlemini durdurun. İçeriği ~15x pipetleyerek karıştırın.
4. Karışımı 100 μm'lik bir gözenekli filtreden süzün. 156 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
5. Süpernatanı çıkarın ve peletin inkübasyonunu 20 mL nötralize edici çözelti ile tekrarlayın. İçeriği 15x pipetleyerek karıştırın ve 156 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
6. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücre peletini 10 mL başlangıç kültür ortamı ile yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 100 mm'lik bir hücre kültürü kabına yerleştirin.
7. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ inkübatörde yetiştirin. Orijinal kültür ortamını her üç günde bir taze epitel hücre ortamı ile değiştirin. Hücreleri kontrol edin ve ortamı her 2 günde bir yenileyin.

4. Hücre geçişi

1. Hücreler %80-90 birleşime ulaştığında 100 mm'lik kabı inkübatörden çıkarın, kullanılan ortamı atın ve kabı 2 mL PBS ile 2 kez durulayın. PBS'yi çıkarın ve ardından her 100 mm'lik tabağa 2 mL% 0.05 tripsin ekleyin.
   NOT: Tripsin çözeltisinin tabağın dibi ile yeterli temas ettiğinden emin olmak için tabağı döndürün.
2. Sindirim işlemi için 100 mm'lik kabı 37 °C'lik bir inkübatöre ~7 dakika yerleştirin.
3. Hücrelerin çoğunun tabağın dibinden ayrıldığından emin olmak için 40x objektif kullanarak hücreleri mikroskopla inceleyin.
4. 8 mL nötralize edici solüsyon ekleyerek sindirim işlemini durdurun ve hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücreleri 10-15 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Hücreleri 156 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
5. Süpernatanı dikkatlice çıkarın, hücreleri 10 mL epitel hücre ortamı ile yeniden süspanse edin ve hücre sayısını sayın.
6. 100 mm'lik bir tabakta 10 mL epitel hücre ortamında 1 ×^{10 6} hücre ekleyin.
7. Epitel hücre ortamını yenileyin ve hücreleri her 2 günde bir gözlemleyin.

5. Hücre kriyoprezervasyonu

1. 4.1-4.4 adımlarını tekrarlayın.
2. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücreleri 2 mL hücre kriyoprezervasyon solüsyonunda yeniden süspanse edin.
3. Hücreleri içeren kriyoprezervasyon solüsyonunun 1 mL'sini her bir kriyojenik şişeye aktarın.
4. Dondurularak saklanmış hücrelerin adlarını, geçiş numaralarını ve tarihlerini kaydedin.
5. Şişeleri gece boyunca -80 ° C'de kontrollü bir dondurma kabına koyun.
6. Kriyojenik şişeleri -80 °C dondurucudan çıkarın ve uzun süreli saklama için hızlı bir şekilde sıvı nitrojene aktarın.

Şekil 1 , prosedürün bir şemasını göstermektedir. Protokol, dispas, kollajenaz ve tripsin gibi bir enzim kombinasyonunun kullanılmasını içerir. Bu kombinasyon, epitel tabakasını altındaki fibroblast tabakasından ayırmak ve daha sonra meme epitel hücrelerini bir süspansiyona ayırmak için tripsin kullanmak amacıyla kullanılır. Ek olarak, epitel hücrelerinin büyümesi, ilk kültür ortamına Y-27632 eklenerek etkili bir şekilde desteklendi. Sonuç olarak, bu yöntem, yalnızca ortalama 10 gün içinde geçiş gereksinimlerini karşılayan çok sayıda HMEC verir.

Y-27632'nin izolasyondan sonra hücre büyümesindeki önemli rolünü test etmek için, yeni izole edilmiş hücreleri iki gruba ayırdık: bir grup, 10 mM Y-27632 içeren başlangıç ortamı ile kaplandı (Şekil 2A); diğer grup, kontrol grubu olarak Y-27632 eklenmeden başlangıç ortamı ile kaplandı (Şekil 2B). 2 günlük kültürden sonra, her iki gruptaki hücreler epidermal hücre ortamına geçirildi (Şekil 1). Şekil 2'den, üçüncü güne kıyasla, Y-27632 ile yapılan yöntemin dokuzuncu günde HMEC sayısını gözle görülür şekilde artırdığını gözlemleyebiliriz. HMEC'ler, belirgin sınırları ve hücreler arasında güçlü bağlantıları olan bir adaya benzeyen uyumlu bir grup oluşturdu. Bu hücreler çevreye doğru genişledi. Y-27632 ile kaplanmış hücreler (Şekil 2A), kontrol grubundaki hücrelerden çok daha hızlı büyüdü (Şekil 2B). Y-27632'nin HMEC büyümesini arttırdığını doğrulamak için, donmuş P0 hücreleri çözüldü ve 10 mM Y-27632 eklenerek veya eklenmeden kaplandı ve geçiş 1 (P1) hücreleri, Şekil 3'te gösterildiği gibi farklı günlerde toplandı. Hücreler, hücre sayım kiti-8 (CCK-8) kullanılarak canlılık ve proliferasyon açısından analiz edildi. Şekil 3'te gösterildiği gibi, Y-27632 içeren ortamla muamele edilen hücrelerin büyüme hızı, Y-27632 içermeyen kontrol grubundaki hücrelerden önemli ölçüde daha yüksekti. Bu veriler bir araya getirildiğinde, ilk ortama Y-27632 ilavesinin, izolasyondan sonra bağlı hücrelerin büyümesini önemli ölçüde arttırdığı görülebilir.

Bu yöntemle elde edilen hücrelerin HMEC'ler olduğunu doğrulamak için, iki meme epitel hücresi belirteci için P0 HMEC'lerin immünofloresan analizini gerçekleştirdik: CK7 ve GATA3. Tanısal olarak önemli bir sitokeratin olan CK7, normal meme epitelinde glandüler farklılaşmanın ve proliferatif epitel süreçlerinin bir belirtecidir13. Ek olarak, Kouros-Mehr ve ark. GATA3'ün meme epitel hücreleri içinde bir transkripsiyon faktörü olarak işlev gördüğünü ve tam gelişmiş meme bezlerinde luminal epitel farklılaşmasının sürdürülmesinde rol oynadığını bildirmişlerdir14. Şekil 3'te gösterildiği gibi, kültürlediğimiz ve genişlettiğimiz hücreler hem CK7'yi (Şekil 4A) hem de GATA3'ü (Şekil 4B) güçlü bir şekilde ifade eder. Hem CK7- hem de GATA3 pozitif hücrelerin kantifikasyon analizi, hücrelerin% 98'inden fazlasının hem CK7 hem de GATA3 eksprese ettiğini gösterdi (Şekil 4C), bu da fibroblastlar gibi diğer hücre tiplerinin sınırlı kontaminasyonunu gösterir. Zaman zaman ilk kültürde sınırlı sayıda fibroblast benzeri hücre (uzamış morfoloji) gözlemledik (P0, Şekil 2), ancak bu hücrelerin pasajlı hücrelerde nadiren göründüğünü görüyoruz (P3, Şekil 4D).

HMEC'lerin epitel karakteristiğinin birkaç geçişten sonra korunup korunamayacağını test etmek için, Y-27632 ile veya Y-27632 olmadan kültürlenen hücrelerde meme epitel hücre belirteçleri CK7 ve GATA3'ün qRT-PCR analizini gerçekleştirdik (Şekil 5). Hem CK7 hem de GATA3'ün ekspresyon seviyeleri, Y-27632 olsun ya da olmasın, hem P0 hem de P3 hücrelerinde önemli ölçüde farklı değildi, bu da fenotipik ve farklılaşma özelliklerinin kültür genişlemesi sırasında zaman içinde değişmediğini gösterdi.

Şekil 1: HMEC'leri izole etmek ve kültürlemek için protokolün akış şeması. Başlangıçta, dişi meme dokusu parçaları cerrahi bıçaklarla dilimlendi ve bir enzim kombinasyonu ile sindirildi. Daha sonra, elde edilen hücre peletleri, 10 mM Y-27632 içeren ilk kültür ortamında kültürlendi. 2 gün sonra, ilk kültür ortamı epitel hücre ortamı ile değiştirildi. Meme epitel hücreleri, ~ 8 gün sonra tatmin edici bir kapsama elde etmek için epidermal hücre ortamında kültürlendi, şimdi pasaj için uygun. Gerekirse, bazı hücreler hücre kriyoprezervasyonuna tabi tutulabilir. Kısaltma: HMEC'ler = insan meme epitel hücreleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: İlk aşılamadan sonra elde edilen HMEC görüntüleri. Aşılamadan sonraki 2 gün içinde, (A) birincil HMEC'ler Y-27632 içeren başlangıç ortamında kültürlendi ve (B) birincil HMEC'ler, Y-27632 içermeyen başlangıç ortamında kültürlendi. 48 saatlik bir kültürleme periyodundan sonra, serumsuz keratinosit kültür ortamı her iki grupta da değiştirildi. Hücrelerin büyüme durumunu gün aşırı kaydetmek için fotoğraflar çekildi. Her iki temsili görüntü serisi, aşılamadan sonraki 3, 5 ve 9. günlerde ters mikroskop (100x) kullanılarak çekildi. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltma: HMEC'ler = insan meme epitel hücreleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Y-27632 ile Passage 1 HMEC'lerin (P1) gelişmiş büyümesi. Donmuş P0 hücreleri çözüldü ve Y-27632 ile veya Y-27632 olmadan kültürlendi. Hücreler (P1) 1, 3, 5, 7 ve 9 günlerde toplandı ve absorbans CCK-8 kiti kullanılarak 450 nm'de analiz edildi. 1. günde, Y-27632 içeren ilk ortamdaki yapışık canlı hücrelerin sayısı, Y-27632 olmayandan önemli ölçüde daha yüksekti. Ek olarak, Y-27632 ile tedavi edilen hücrelerin büyüme eğrisi daha dik bir artış gösterdi. **p < 0.01, ***p < 0.001. Kısaltma: HMEC'ler = insan meme epitel hücreleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: HMEC belirteçlerinin ifadesi (P0). HMEC'lerde CK7 ve GATA3 ekspresyonu immünofloresan boyama ile analiz edildi. HMEC'ler (A) CK7 (kırmızı) ve (B) GATA3 (kırmızı); Çekirdekleri boyamak için DAPI (mavi) kullanıldı. Görüntüler lazer taramalı konfokal mikroskop (400x) kullanılarak çekildi. Ölçek çubukları = 20 μm. (C) Boyamadaki pozitif hücrelerin yüzdesi; (D) HMEC'lerin temsili görüntüsü (P3). Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: HMEC'lerin CK7 ve GATA3'ünün P0 ve P3'teki ifadesi. 7. günde P0 ve P3 HMEC'lerinde (A) CK7, (B) P0 ve P3 HMEC'lerinde GATA3, (C) 7. günde Y27632 ile veya Y27632 olmadan kültürlenen P1 HMEC'lerde CK7 ekspresyonunu tespit etmek için qRT-PCR kullanma, (D) 7. günde Y-27632 ile veya Y-27632 olmadan kültürlenen P1 HMEC'lerde GATA3. NSP > 0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar, bu makalenin yayınlanması ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.