Farelerde Hipokampusun Dentat Girusundaki Granül Hücrelerin İn Vivo Kalsiyum Görüntülenmesi

Önceki çalışmalar, hipokampusun anıları işlemek ve geri almak için gerekli bir beyin yapısı olduğunu buldu ^1,2. 1950'lerden bu yana, kemirgenlerdeki hipokampusun nöral devreleri, hafıza oluşumu, depolanması ve geri çağrılması çalışmalarında odak noktası olmuştur³. Hipokampus içindeki anatomik yapılar, dentat girus (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 ve subiculum^4'ün alt bölgelerini içerir. Bu alt bölgeler arasında karmaşık çift yönlü bağlantılar bulunur ve bunlardan DG, CA1 ve CA3, granül hücreler ve piramidal hücrelerden oluşan belirgin bir trisinaptik devre oluşturur⁵. Bu devre, birincil girdisini entorinal korteksten (EC) alır ve sinaptik plastisiteyi incelemek için klasik bir model olmuştur. Daha önce in vivo hipokampus fonksiyonu üzerine yapılan araştırmalar, daha kolay erişimi nedeniyle çoğunlukla CA1 ^6,7 üzerinde yoğunlaşmıştır. CA1 nöronları, özellikle uzamsal hafıza için yer hücrelerinde hafıza oluşumu, konsolidasyonu ve geri alınmasında önemli roller üstlenirken, hipokampusun diğer alt bölgeleri de hayati öneme sahiptir ^8,9. Özellikle, son çalışmalar DG'nin hafıza oluşumundaki işlevlerini vurgulamıştır. DG'deki yer hücrelerinin CA1^{10'dakilerden} daha kararlı olduğu bildirilmiştir ve aktiviteleri bağlama özgü bilgileri^{yansıtır 11}. Ayrıca, DG granül hücrelerinin aktiviteye bağlı etiketlemesi, hafıza ile ilgili davranışları indüklemek için yeniden etkinleştirilebilir¹². Bu nedenle, DG'deki bilgi kodlaması hakkında daha derin bir anlayış kazanmak için, hayvan hafızaya bağlı görevleri yerine getirirken DG alt bölgesinin aktivitelerini araştırmak çok önemlidir.

DG aktiviteleri ile ilgili önceki çalışmalar çoğunlukla in vivo elektrofizyoloji¹³ olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu tekniğin bazı dezavantajları vardır: Birincisi, elektrik kayıtlarında, sinyali üreten çeşitli hücre türlerini doğrudan tanımlamak zor olabilir. Kaydedilen sinyaller hem inhibitör hem de uyarıcı hücrelerden gelir. Bu nedenle, bu iki hücre tipini ayırmak için daha fazla veri işleme yöntemi gereklidir. Ayrıca, projeksiyona özgü alt gruplar veya aktiviteye bağlı etiketleme gibi diğer hücre tipi bilgilerini elektrikli kayıtlarla birleştirmek zordur. Ek olarak, DG'nin anatomik morfolojisi nedeniyle, kayıt elektrotları genellikle ortogonal bir yönde implante edilir, bu da kaydedilebilecek nöron sayısını büyük ölçüde sınırlar. Bu nedenle, elektrik kayıtlarının aynı hayvanda DG yapısından yüzlerce bireysel nöronun izlenmesini sağlamak zordur¹⁴.

DG'de nöron aktivitelerini kaydetmenin tamamlayıcı bir tekniği, in vivo kalsiyum görüntülemenin^{kullanılmasıdır 15}. Kalsiyum iyonları, organizmalardaki hücresel sinyalleşme süreçleri için temeldir ve özellikle memeli sinir sistemi içinde birçok fizyolojik fonksiyonda çok önemli bir rol oynar. Nöronlar aktif olduğunda, hücre içi kalsiyum konsantrasyonu hızla artar ve nöronal aktivitenin ve sinyal iletiminin dinamik doğasını yansıtır. Bu nedenle, nöronlardaki hücre içi kalsiyum seviyelerindeki gerçek zamanlı değişikliklerin kaydedilmesi, nöral kodlama mekanizmaları hakkında önemli bilgiler sağlar.

Kalsiyum görüntüleme teknolojisi, floresan yoğunluğundaki değişiklikleri tespit ederek nöronlardaki kalsiyum iyon konsantrasyonlarını izlemek için özel floresan boyalar veya genetik olarak tasarlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler) kullanır ve bunlar daha sonra mikroskobik görüntüleme ile yakalanabilir¹⁶. Yaygın olarak, yeşil floresan proteini (GFP), kalmodulin ve M13 polipeptit dizilerini içeren GCaMP kalsiyum indikatör genleri ailesi kullanılır. GCaMP, kalsiyum iyonlarına¹⁷ bağlandığında yeşil floresan yayabilir ve yeşil floresanstaki dalgalanmaların görüntüleme¹⁸ aracılığıyla kaydedilmesine izin verir. Ek olarak, hedef beyin bölgesinin net görüntülerini elde etmek için, tipik olarak ilgilenilen bölgenin üzerine bir Gradyan İndeks Lensi (GRIN lens) implante edilir. GRIN lens, doğrudan yüzeyden erişilemeyen derin beyin bölgesinin görüntülenmesini sağlar.

Bu tekniğin, farklı hücre tiplerini etiketlemek için diğer genetik araçlarla birleştirilmesi nispeten kolaydır. Ayrıca, görüntüleme düzlemi DG'deki hücrelerin oryantasyonuna paralel olduğundan, her başarılı ameliyatta görüntüleme için yüzlerce nörona erişilebilir. Bu çalışmada, farelerde dentat girusta in vivo kalsiyum görüntüleme için tam ve ayrıntılı bir cerrahi protokol sunuyoruz (Şekil 1). Prosedür iki ana operasyonu içerir. Birincisi, AAV-CaMKIIα-GCaMP6f virüsünü DG'ye enjekte etmektir. İkinci işlem, virüs enjeksiyon bölgesinin üzerine bir GRIN lensi implante etmektir. Bu iki işlem aynı oturuşta gerçekleştirilir. Bu ameliyatlardan sonra iyileşme sağlandıktan sonraki adım, minyatür mikroskoplar (miniskoplar) ile görüntüleme kalitesini kontrol etmektir. Görüntüleme alanında yüzlerce aktif hücre varsa, sonraki prosedür, minoskop taban plakasını diş çimentosu kullanarak fare kafatasına tutturmaktır; Fare daha sonra görüntüleme deneyleri için kullanılabilir. Ayrıca, toplanan kalsiyum verilerinin analizini kolaylaştırmak için MATLAB tabanlı bir ön işleme hattı sunuyoruz.

Tüm hayvan prosedürleri Fudan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (202109004S). Bu çalışmada kullanılan tüm hayvanlar 6 aylık C57BL / 6J; Her iki cinsiyet de kullanıldı. Fareler, sabah 8'den akşam 8'e kadar 12 saatlik bir ışık döngüsünde tutuldu. Virüs enjeksiyonu için aşağıdaki koordinatları kullandık: A/P: -2.2 mm, M/L: 1.5 mm, D/V: beyin yüzeyinden 1.7 mm.

1. Dentat girusa virüs enjeksiyonu

1. Tek kullanımlık steril eldivenler ve önlükler de dahil olmak üzere koruyucu ekipman giyin.
2. Gerekli cerrahi aletleri, iki tüp 5 mL salin (% 0.9 NaCl [steril] veya yapay beyin omurilik sıvıları) ve iki adet 25 G luer kilitli künt iğneyi hazırlayın.
   NOT: Tüm cerrahi aletler ameliyattan önce iyice sterilize edilmelidir. Cerrahi aletleri sterilize etmek için yüksek sıcaklıkta (121-134 °C) ve basınçta (20 psi) otoklavlama kullandık. Ayrıca yüzeylere alkol bazlı dezenfektanlar püskürttük. Tüm cerrahi işlemlerde %0.9 steril serum fizyolojik kullandık. Aletler ameliyat sırasında ısıtılmış cam boncuklarla aralıklı olarak sterilize edildi.
3. Virüsle temas edebilecek malzemeleri dezenfekte etmek için suda% 10'luk bir çamaşır suyu çözeltisi hazırlayın.
4. Gerekirse AAV-CaMKIIα-GCaMP6f virüsünü sterilize tuzlu su kullanarak seyreltin ve 4 ° C buzdolabında veya buz üzerinde saklayın. Virüsün hedef son titresi 1 × 10¹² GC/mL'dir.
   NOT: Virüs bütünlüğünü korumak için virüsün tekrarlanan donma-çözülme döngülerinden kaçınmanızı öneririz. Bu amaçla, üreticiden küçük hacimlerde (örneğin, tüp başına 2 μL) alındığında genellikle virüsü ayırır ve bunları -80 ° C'lik bir dondurucuda saklarız. Virüs çözüldüğü gün kullanılmalı ve uzun süreli kullanım için 4 °C'de saklanmamalıdır.
5. Mikropipeti ince bir uca çekmek için bir mikropipet çektirme kullanın, ucun küçük bir kısmını cerrahi makasla kesin ve tüpü mineral yağ ile doldurun. Pipetin sıvıyı normal şekilde emdiğinden emin olun ve ardından enjektöre takın.
   NOT: Isıtıcı maksimum gücün ~%60'ına ayarlanmışken tek adımlı bir çekme yöntemi kullandık. Bu adım için başka çektirmeler de kullanılabilir. Genel amaç, ucu ~ 50-100 μm çapında yapmaktır; çok küçük bir çap sıvının akışını etkileyecektir; Çok kalın, farenin beyin dokusuna zarar verebilir.
6. Fare anestezi makinesi, sıcaklık bakım makinesi (ısıtma yastığı) ve vakum pompası dahil tüm aletleri açın. Ek olarak, ameliyattan önce farelerin vücut ağırlığını ölçün.
   NOT: İşlem sırasında, farenin solunumunu görsel olarak izledik ve iyi durumda olduklarından emin olmak için ara sıra vücut ısısını kontrol ettik.
7. Fareyi %2,5 izofluran ve 1 L Oksijen/dk içeren gaz odasına yerleştirin. Anestezi durumunu ölçmek için farenin solunum koşullarını izleyin.
   NOT: Fareyi sağlıklı tutmak için solunum hızı yaklaşık 1 nefes/sn olmalıdır.
8. Fareyi gaz odasından çıkarın ve stereotaksik cihazın üzerine yerleştirin.
9. Bir sonraki işleme başlamadan önce farenin yeterince uyuşturulduğundan emin olun. Her iki arka ayağın ayak pedlerini sıkıştırarak pedal çekme refleksini test edin. Fare ayak pedi sıkışmasına yanıt verirse, ek anestezi uygulayın ve devam etmeden önce refleksi yeniden test edin.
10. Fare burnunu bir maske ile kapatın ve izofluran akış hızını% 1,5'e ayarlayın. Fare kafasını kulak çubuklarıyla sıkıca sabitleyin (Şekil 2A).
    NOT: Kulak çubuklarını fareye çok sıkı takmamaya dikkat edin, çünkü bu, farenin nefes almasını kolayca etkileyebilir ve bazı durumlarda ölüme neden olabilir.
11. Fare kafasının üst kısmını cerrahi makasla kesin ve cilt tamamen açığa çıkana kadar kalan tüyleri almak için tüy dökücü krem kullanın. Tüy dökücü kremi farenin saç derisine uygulayın, yaklaşık 5 dakika bekletin ve kremi silmek için gazlı bez kullanın.
12. Farenin gözlerine oftalmik merhem sürün.
13. Pamuklu çubuklar kullanarak saçsız bölgeyi iyodofor dezenfektan ve% 75 etanol ile dezenfekte edin.
14. Cerrahi makas (veya neşter bıçağı) kullanarak kafa derisinin orta hattı boyunca sürekli bir kesi yapın ve kafatası yüzeyini ortaya çıkarmak için kafa derisinin bir kısmını kesin (Şekil 2B). Kafatasının yüzeyini tuzlu su ile durulayın; Ardından, bir vakum pompası kullanarak ön panoyu ve aşırı tuzlu suyu çıkarın. Yaranın etrafındaki alan kanamayı durdurana kadar bu işlemi birkaç kez tekrarlayın. Kuru tutmak için kafatasının yüzeyini pamuklu çubuklarla silin.
    NOT: Ön panoyu çıkarmanın, pamuklu top veya pamuklu çubukla silmek gibi başka yolları da vardır.
15. Bregma ve lambda göründüğünde kraniyal yüzeyi ayarlamak için yerleştirme iğnesini kullanın. Tüm kafa düzleşene kadar birkaç ayar yapın (Z ekseni yönündeki tüm hata 0,05 mm'den azdır).
16. İğnenin ucunu bregmadan uygun hedef konuma getirin. Hedef koordinatlar için referans noktası olarak bregma'yı kullanın. Virüs enjeksiyon bölgesinin çevresini tanımlamak için dört noktayı işaretleyin: A/P: -2,0 mm, M/L: -1,5 mm; S/Kalma: -2,5 mm, E/Y: -1,5 mm; A/P -2,25 mm, M/L: -1,0 mm; ve A/P -2,25 mm, M/L: -2,0 mm, silinebilir bir işaretleyici ile.
    NOT: Bu protokol aynı ameliyatta virüs enjeksiyonu ve GRIN lens implantasyonunu gerçekleştirir. Bu protokolde tüm ameliyatlar sağ hemisferde yapıldı ancak her iki hemisferin de kullanılabileceği düşünülebilir. Yukarıda belirtilen dört nokta ile tanımlanan enjeksiyon alanı içinde, virüsü farklı yerlere üç ayrı 80 nL dozda enjekte edin. Üç yer keyfi olarak seçilmiş olsa da, virüsün daha iyi yayılması için dağıtılmalarını öneririz. Bu, enfekte olmuş hücrelerin sayısını artıracaktır.
17. Mikrodrill ile bölgedeki kraniyotomiyi yapın ve bu dört noktayı sınır olarak ayarlayın. Beyin dokusu görünür olduğunda delmeyi durdurun (Şekil 2C).
    NOT: Kafatasını yavaşça delmeye çalışın. Matkap ucu, aşırı kuvvet nedeniyle beyin dokusuna zarar verebilir. Yavaş sondaj, beynin aşırı ısınmasını da önleyebilir.
18. Ultra ince forseps kullanarak kemik kalıntılarını ve duraları çıkarın ve bu alanı steril tuzlu su ile sürekli durulayın.
    NOT: Bazı kılcal damarlar yırtıldığı için bu aşamada az miktarda kanama olması normaldir; Daha fazla kanama olmayana kadar tuzlu su ile durulamaya devam edin.
19. Virüsün sonraki yüklenmesi için gerekli alanı oluşturmak üzere bir miktar mineral yağı çıkarmak için enjektörün kontrol panelini kullanın. Mikropipeti 100 nL/s hızında en az 240 nL seyreltilmiş virüs ile doldurun.
    NOT: Mikropipetin uygun miktarda sıvı dağıtmasını garanti etmek için tüpteki hava kabarcıkları kontrol paneli kullanılarak boşaltılmalıdır. Birden fazla denemeden sonra sıvı hacmi hala yanlışsa, mikropipeti değiştirmeyi ve baştan başlamayı düşünün. Gerçek enjeksiyon hacminden daha fazla virüs aspire etmenizi öneririz; Bu yaklaşım, mineral yağın yanlışlıkla fare beynine enjekte edilmesini önler.
20. Mikropipeti kraniotomi bölgesinin üzerine getirin; daha sonra, beyin yüzeyinin 1,70 mm altında, hedeflenen D / V Z eksenine yavaşça beyin dokusuna doğru hareket ettirin.
    NOT: Birçok referans atlasında kafatası yüzeyi D/V 0 olarak kullanılmaktadır. Deneyimlerimize göre, beyin yüzeyinden alınan koordinatları kullanmak DG için daha güvenilir hedefleme sağladı.
21. Enjektörü 1 nL/s'lik bir akış hızında 80 nL virüs enjekte edecek şekilde ayarlamak için kontrol panelini kullanın (Şekil 2D). Virüsü enjekte etmek için kontrol panelindeki INJECT düğmesine tıklayın. Daha sonra, kraniyotomi içinde iki pozisyon daha seçin ve önceki işlemi tekrarlayın.
    NOT: Her enjeksiyon ~ 2 dakika sürer. Enjeksiyonu bitirdikten sonra, başka bir pozisyona geçmeden önce 8-10 dakika daha bekleyin. Çıkarma sırasında kanama meydana geldiğinde, derhal tuzlu su ile yıkayın.
22. Mikropipeti beyinden yavaşça çıkarın (Şekil 2E).

2. Dentat girusta GRIN lens implantasyonu

NOT: 240 nL viral enjeksiyonu tamamladıktan hemen sonra bu adımı gerçekleştirin.

1. 1 mm çapındaki GRIN lensini %75 etanol içinde 20 dakika dezenfekte edin; İmplantasyondan önce tuzlu su ile düzgün bir şekilde durulayın.
2. A/P yönündeki açıklığı yaklaşık 1 mm'ye çıkarmak için mikromatkabı kullanarak kraniyotomiyi genişletin. Kalıntıları tuzlu suyla temizleyin.
3. GRIN lensini bir tutucu ile yerine sıkıştırın ve yeterli uzunlukta pozlama yaptığınızdan emin olun.
   NOT: Sonraki adımlarda UV reçinesi kullanarak kafatasına sabitlerken tutucuyu GRIN lense yapıştırmak kolaydır. Bununla birlikte, lensin açıkta kalan uzunluğu yeterliyse bu önlenebilir.
4. GRIN lensini kraniyotomi bölgesinin üzerine hareket ettirmek için tutucuyu kullanın. GRIN lensin alt kısmı beyin dokusunun yüzeyine temas ettiğinde Z ekseni konumunu sıfıra ayarlayın. Ardından GRIN lens tutucuyu çıkarın ve bir kenara koyun.
5. 25 G luer lock kör iğneyi vakum pompası emme borusuna takın ve basıncı 0.04 MPa'ya ayarlayın.
   NOT: Bu adım ilk kez gerçekleştirilirse, beyin dokusunu yavaşça aspire etmek için basınç uygun şekilde azaltılabilir.
6. Künt iğnenin ucunu beyin dokusunun üzerinde yakın bir şekilde döndürerek beyin dokusunu kesin ve aspirasyonu kolaylaştırmak için beyin dokusuna hafifçe bastırın. Beynin net bir şekilde görülebilmesini sağlamak için emme sırasında sürekli olarak tuzlu su ile durulayın (4 °C'de saklayın). Aspirasyon derinliğini izlemek için doku özelliklerini yakından gözlemleyin: kortikal doku soluk pembe, alttaki korpus kallozum beyaz, fibröz doku olarak görünür ve hipokampal CA1 tabakası koyu kırmızı ve gridir. Doku yüzeyi pürüzsüz hale geldiğinde ve geniş bir CA1 alanı açığa çıktığında emmeyi durdurun (Şekil 3).
   NOT: Bu adım, tüm prosedürün başarısı için kritik öneme sahiptir ve genellikle en zor kısımdır. Okuyucuların bu adımda sorun gidermelerine yardımcı olmak için yaygın sorunların bir listesini sağladık (Tablo 1). Ayrıca, kanamayı bir dereceye kadar azaltabileceğinden, yaranın sürekli olarak soğuk tuzlu su ile durulanmasını öneririz.
   1. İğne tıkanırsa; Tıkalı iğneyi bir şırıngaya takın ve tıkanıklığı yıkayın. Bu işe yaramazsa iğneyi değiştirmeyi deneyin.
   2. Kanama sürekli ise beyin dokusunun görüşünü engelleyebilir. Bu olursa, kanın pıhtılaşmasını bekleyin, ardından tuzlu su ile durulayın.
7. Tutucuyu delinmiş deliğin üzerine getirin. GRIN lens beyin dokusunun yüzeyine temas ettiğinde Z eksenini 0'a ayarlayın. GRIN lensi deliğin çapını aşarsa, deliği genişletmek için mikro matkabı kullanın. Ardından, bu yordamı tekrarlayın.
8. GRIN lensi D/D'deki deliğe yerleştirin: -1.32 mm. Tutucuyu 5-10 dakika bekletin. Tutucuyu yükselttikten sonra deliği tuzlu su ile durulayın. Bu adımı 3 kez tekrarlayın (Şekil 4A).
   NOT: Bu aşamada beyin dokusunun kanaması normaldir. Tekrarlanan tuzlu su durulamalarından sonra, delikte daha fazla kan olmamalıdır. Görüntüleme kalitesi bu adımdan büyük ölçüde etkilenir ve kan temizlenmezse görüntüleme alanının siyah olmasına neden olabilir.
9. Kafatasını iyice temizlemek için tuzlu su kullanın ve ardından UV reçinesini uygulamadan önce kafatasının kurumasını bekleyin.
10. UV reçinesini GRIN lensin etrafına uygulamak için bir iğne kullanın. Bu alanı 15 saniye boyunca bir UV ışığı ile aydınlatın ve UV reçinesinin katılaşmasını sağlayın (Şekil 4B).
    NOT: UV reçinesini azar azar uygulayın ve GRIN lensin etrafındaki alan kaplanana kadar bu işlemi birkaç kez tekrarlayın. Aydınlatma için UV ışığını kullanırken GRIN lensi tutucuya yapıştırmamaya dikkat edin.
11. Tutucuyu GRIN lensten dikkatlice çıkarın. Açıkta kalan tüm kafatasını UV reçinesi ile kaplayın ve kafa plakasını kafatasının üzerine uygun pozisyonda yerleştirin. Tüm kafatasını ve kafa plakasını 15 saniye boyunca UV ışığı ile aydınlatın (Şekil 4C).
    NOT: Başlık plakası, taban plakasını takarken farenin kafasını güvenli bir şekilde yerinde tutmak için kullanılan bir bileşendir (tasarım için Ek Dosya 1'e bakın). Kafa plakasını mümkün olduğunca sıkı bir şekilde sabitleyin; Müstakil bir kafa plakası, tüm ameliyatın başarısız olmasına neden olacaktır. Deneyimlerimize göre, UV reçinesinin kapsamlı bir şekilde uygulanması, sağlam bir bağlantı sağlayabilmelidir. Daha güçlü bir bağlantı gerekiyorsa, kafatası vidalarının takılması düşünülebilir.
12. Açıkta kalan GRIN lensini 3D baskılı bir koruyucu kapakla kapatın (Tasarım için Ek Dosya 2'ye bakın). M1.6 vidaları kullanarak kapağı başlık plakasına sabitleyin (Şekil 4D).
13. Postoperatif iltihabı önlemek için ameliyattan sonra intraperitoneal olarak (%0.9 salin içinde çözülmüş, 2 mg / kg) deksametazon enjekte edin. Ek olarak, postoperatif ağrıyı azaltmak için deri altı carprofen enjeksiyonları (% 0.9 salin, 5 mg / kg içinde çözülmüş) uygulayın.
14. Fareleri kafese geri koyun ve iyileşmelerini kolaylaştırmak için termal bir battaniyeye aktarın. Ardından, fareleri serbestçe hareket edebildikten sonra deney hayvanı barınağına aktarın.
    NOT: Taban plakasının kavga yoluyla hasar görmesini önlemek için, ameliyat geçirmiş fareler tek tek veya minimum sayıda birlikte yaşayan kişi ile barındırılabilir. Ameliyattan sonra bir kafeste üç fareyi geçmemenizi öneririz.
15. Çalışma yüzeylerini% 10'luk bir çamaşır suyu solüsyonu kullanarak dezenfekte edin. Tek kullanımlık kişisel koruyucu ekipmanı (KKD) çıkarın ve biyolojik tehlike torbalarına atın.
16. Ameliyattan sonraki 3 gün boyunca fareleri günlük olarak izleyin. Farelerin vücut ağırlığını kaydedin ve yara iyileşme durumlarını ve hareket aktivitelerini gözlemleyin. 3 gün boyunca günlük intraperitoneal deksametazon ve carprofen solüsyonları (adım 2.13'teki ile aynı dozaj) sağlayın. Gerektiğinde iyileşmeyi kolaylaştırmak için nemli yemek veya tedavi sağlayın.

3. Görüntüleme alanının kalitesini kontrol edin

NOT: Fare, ilk in vivo kalsiyum görüntüleme seansından önce ameliyattan 2-3 hafta sonra iyileşir. Bu adımın amacı, ameliyatın kalitesini ve farenin iyileşmesini kontrol etmektir. Görüntüleme alanında tek hücreli aktivite gözlemlenebiliyorsa ve fare iyi durumdaysa, taban plakasını fare kafatasına yapıştırın. Görüntüleme kalitesi veya sağlık durumu yeterli değilse fareye servikal çıkık ile ötenazi yapılmalıdır.

1. Miniskop veri toplama Kutusunu bir USB 3.0 kablosuyla bilgisayara bağlayın. Ardından Koaksiyel Kabloyu Kapsam konektörü (SMA) aracılığıyla Kutuya bağlayın.
2. Miniskop kontrol Yazılımını açın. Yazılımda, Yapılandırma Dosyası Seç'e tıklayın | Canlı görüntüleri görüntülemek için Kullanıcı Yapılandırma Dosyaları V4 plus .
3. Kafa plakasını sıkıştırarak fareyi koşu tekerleği üzerinde tutmak için özelleştirilmiş bir tutucu kullanın. Minoskopu minoskop tutucusu ile tutun (3D baskı ile yapılmıştır; tasarım için Ek Dosya 3'e bakın) ve miniskopu farenin başının üzerine hareket ettirmek için stereotaksik bir alet kullanın (Şekil 4E).
4. Kapağı bir tornavidayla çıkarın. GRIN lensin yüzeyini %75 etanol ile nazikçe silin. Minoskopu açıkta kalan GRIN merceğinin hemen üzerine yerleştirin ve dürbünün alt yüzeyini merceğin yüzeyine paralel hale getirin. Minoskopu yavaşça GRIN lense doğru indirerek en iyi odak düzlemini bulun.
   NOT: Odak düzlemini 0'a ayarlayın, ardından miniskopun konumunu ayarlayın; Bu, odağı ayarlamak için daha fazla alan sağlar. En fazla sayıda hücrenin net bir görselleştirmesi ile odak düzlemini seçin.
5. Minoskop kontrol Yazılımında, LED ışık gücünü optimum seviyeye ayarlayın.
   NOT: Tek hücreli aktiviteyi gözlemlemek için, görüntüleme alanı ne aşırı pozlanmış ne de çok karanlık olmalıdır. LED yoğunluğu tipik olarak %10 içindedir.
6. Vasküler kan akışı görülebiliyorsa ve hücreler çok sayıdaysa ve görüntüleme alanı boyunca düzgün bir şekilde dağılmışsa, deneyin bir sonraki bölümüne geçin.
   NOT: Bu adımda, tek hücre aktivitesini gözlemleyebilmek önemlidir. Bu, veri analizinin sonuçlarını etkileyebilir. Normalde, bölgesel aktivitelerin (floresan dalgalanma lekeleri) yorumlanması zordur. Bu, hedef nöronların GRIN merceğinin odak dışında olduğunun bir göstergesi olabilir. Görüntüleme alanının siyah olduğu, hücrelerin bölgesel aktivite sergilediği veya yetersiz sayıda hücre olduğu görülürse, fare sonraki deneylerde kullanılmayacaktır.
7. Kabloyu miniskoptan çıkarın.

4. Minoskop taban plakasını fare kafatasına takın

1. Taban plakasını miniskopa takın ve iyi görüntüleme kalitesine sahip bir görüş alanı elde etmek için miniskopun konumlarını yeniden ayarlayın.
2. Protez taban malzemelerini karıştırma kabında karıştırın.
   NOT: Karışımın ne çok serbest akması ne de çok sert olması önemlidir. Çok fazla akışkanlık, GRIN lensin yüzeyini kaplama eğilimindedir ve görüntüleme alanı kaybına neden olur. Çok sertse, protez taban malzemeleri taban plakası ile kafa plakası arasındaki boşluğu sıkıca kapatamayacaktır.
3. Protez taban malzemelerinin ilk katmanını miniskop taban plakasının etrafına dikkatlice uygularken miniskopun konumunu değiştirmemeye dikkat edin. Taban plakasından başlık plakasına ikinci bir çimento tabakası uygulamadan önce ilk çimento tabakasının sertleşmesini bekleyin. Tüm protez taban malzemeleri sertleştikten sonra, ayar vidasını gevşetin ve miniskopu taban plakasından ayırın.
   NOT: Protez taban malzemelerini kullanırken, yazılımdaki görüntüleme alanına dikkat edin ve seman katılaşmadan önce gerekli ayarlamaları yapın.
4. Tutma kolunu miniskoptan yavaşça çıkarın.
5. Açıkta kalan GRIN lensini korumak için taban plakası kapağını taban plakasına yerleştirin ve ayar vidasını sıkın (Şekil 4F).
6. Fareyi ev kafesine geri yerleştirin. Davranışsal deneyleri gerçekleştirmeden önce fareye iyileşmesi için birkaç gün verin.

5. Veri toplama

NOT: İn vivo kalsiyum görüntüleme, herhangi bir davranış testi ile eş zamanlı olarak gerçekleştirilebilir. Bu protokolde örnek olarak doğrusal yolu kullanıyoruz. Bu doğrusal iz 1,5 m'dir ve her iki ucunda da su vardır, bu da fareler için bir ödül görevi görür. Fareler minyatür bir mikroskop (miniskop) takabilir ve 20 dakikalık bir süre boyunca pist boyunca ileri geri koşabilir. Bu süre zarfında, fareler tipik olarak ~ 60 deneme yapabilir.

1. Miniskop veri toplama Kutusunu bir USB 3.0 kablosuyla bilgisayara bağlayın. Ardından Koaksiyel Kabloyu To Scope (SMA) konektörü aracılığıyla Kutuya bağlayın.
2. Miniskop kontrol Yazılımını açın. Miniscope kontrol Yazılımında, Yapılandırma Dosyası Seç'e tıklayın | Canlı görüntüleri görüntülemek için Kullanıcı Yapılandırma Dosyaları V4 plus .
3. Endüstriyel kamerayı bir USB 3.0 kablosuyla bilgisayara bağlayın.
4. Fotoğraf makinesi kontrol yazılımını açın. Yazılımda, Ekipmanı Aç'a tıklayın ve veri toplama parametrelerini içe aktarmak için dosyayı seçin. AVI Container'da video formatını Sıkıştırılmamış Video olarak seçin. Canlı görüntüleri görüntülemek için Başlat düğmesine tıklayın.
   NOT: Davranışsal kayıt videosunun dosya boyutunu küçültmek için, görüş alanı parçanın dışındaki gereksiz alanları hariç tutmalıdır.
5. Kafa plakasını sıkıştırarak fareyi koşu tekerleği üzerinde tutmak için özelleştirilmiş bir tutucu kullanın.
6. Ayar vidasını bir tornavidayla gevşetin, taban plakası kapağını çıkarın ve GRIN lensin yüzeyini %75 etanol ile temizleyin.
7. Miniskopu tabanına monte edin. Miniskopu farenin kafasındaki tabanına sabitleyin.
8. Odak düzlemi düğmesini kaydırarak en iyi odak düzlemini bulun.
9. Fareyi koşu tekerleğinden doğrusal yola yavaşça hareket ettirin.
10. Miniskop ile kayda başlamak için Kaydet düğmesini tıklayın ve basılı tutun. Ardından, tıklayın Toplamaya başla Kamera kaydını başlatmak için düğmesine basın. 20 dakika boyunca kayıt yapın.
11. İn vivo kalsiyum görüntüleme verilerini, davranışsal verileri ve Arduino verilerini ayrı ayrı kaydedin. Bu dosyaları tarih, oturum numarası ve fare numarasıyla adlandırın.
    NOT: Bir miniskop kullanan çalışmalar, tek bir deney hayvanı üzerinde uzun vadeli bir veri toplama süresine sahip olma eğilimindedir. Dosyaların net bir şekilde adlandırılması, veri işleme prosedürüne yardımcı olabilir.
12. Miniskopu tabanından ayırın.
13. Kamera kontrol yazılımını, miniskop kontrol yazılımını ve bilgisayarı kapatın.
14. Koaksiyel kabloyu Kapsam Kapsamından (SMA) ve USB 3.0 kablosunu kameradan çıkarın.
15. Tabandaki ayar vidasını sökün, taban plakası kapağını geri takın ve vidayı sıkın.
16. Fareyi ev kafesine geri koyun.

6. Veri işleme

1. Kaydedilen kalsiyum görüntüleme verilerini MATLAB'a yükleyin.
   NOT: Verilerin analizinin deney tasarımına göre uyarlanması gerektiğinin farkındayız. Burada, ham kalsiyum görüntüleme videosunu tek tek hücrelerden gelen aktivite izlerine dönüştüren bir ön işleme hattı sunuyoruz. Bu prosedürün kullanıcılar için nispeten evrensel ve yararlı olduğuna inanıyoruz. Bu bölümde açıklanan tüm komut dosyaları Ek Dosya 4'te bulunabilir.
2. Görüntüleme verilerini AVI'den HDF5 (.h5) formatına dönüştürün.
   NOT: Minoskopun ham çıktısı, sıkıştırmalı AVI dosyaları oluşturur. Sıkıştırılmamış dosyalar genellikle onlarca gigabayt boyutundadır. HDF5 dosya formatı, sonraki analizler için kolayca görselleştirilebilen ve manipüle edilebilen sanal ve kısmi erişime izin verir.
3. Rijit Olmayan Hareket Düzeltmesini (NoRMCorre)¹⁹ uygulayın.
4. Daha sonraki adımlar için bilgisayarın RAM'inin sınırlı olması ihtimaline karşı, hareket düzeltmeli filmi aşağı örnekleyin.
   NOT: Miniskop tarafından toplanan orijinal veriler 600 x 600 boyutundadır. Uzamsal bir aşağı örnekleme kullanarak video boyutunu 200 x 200'e düşürebiliriz. Bu yöntem, veri depolama gereksinimlerini önemli ölçüde azaltır ve daha hızlı veri işlemeye olanak tanır.
5. Çevrimiçi depo^{20'deki (https://github.com/schnitzer-lab/EXTRACT-public} ) EXTRACT kodu talimatlarını izleyerek, tek hücreli sinyalleri tanımlamak için aşağı örneklenmiş verilere EXTRACT uygulayın.

Şekil 1 , virüs enjeksiyonu, GRIN lens implantasyonu, taban plakası ekfiksasyonu, bir miniskop aracılığıyla in vivo kalsiyum görüntüleme ve veri işleme dahil olmak üzere deneysel prosedürün şemasını göstermektedir. Genel olarak, tüm prosedür 1 ay sürer. Şekil 2 , kafatası üzerinde açılan deliğin konumlandırılması ve GRIN lens implantasyonundan önce beyin dokusunun durumu dahil olmak üzere örnek virüs enjeksiyon prosedürlerini göstermektedir.

Şekil 3 , bu ameliyatın başarısı için çok önemli olan beyin dokusunun çıkarılması sürecini göstermektedir. Daha fazla doku emildikçe, farklı doku katmanları görünür hale gelir. Bu emme adımı, gri, yansıtıcı bir tabaka gözlemlendiğinde durdurulabilir.

Şekil 4 , GRIN merceğinin yerleştirilmesi, kafa plakasının kafatasına yapıştırılması ve GRIN merceğinin özelleştirilmiş bir kapakla kaplanması dahil olmak üzere GRIN implantasyon prosedürünü göstermektedir. İn vivo kalsiyum görüntülemenin görüntüleme kalitesi, virüs enjeksiyonunun ve GRIN lens implantasyonunun başarısına bağlıdır.

Şekil 5, in vivo kalsiyumgörüntülemeden elde edilen dört tür sonucu göstermektedir.Şekil 5A başarısız sonuçtur; Görüntüleme görüş alanında aktif hücre gözlenmedi. Şekil 5B-D başarılı sonuçlardır. Şekil 5B'de 10'dan az aktif hücre vardır, ancak belirgin bir kan damarı yoktur. Şekil 5C, 50'den fazla aktif hücreye ve görünür kan damarlarına sahiptir. Şekil 5D'de, görüntüleme görüş alanında yüzlerce aktif hücre vardır; Aynı zamanda, temiz kan damarları gözlemledik. Yüksek kaliteli in vivo kalsiyum görüntüleme tipik olarak yüzlerce aktive edilmiş hücreye sahiptir. Bir düzineden az aktive edilmiş hücrenin görüntüleme sonuçları için yetersiz olduğu düşünülmektedir. Genellikle, hücre sayısı GRIN merceğinin çapı ve beyin bölgesinin bir kısmı ile ilişkilidir. Daha büyük bir GRIN lens çapı ve sırt tarafına daha yakın bir beyin bölgesi, daha aktif hücrelerin gözlemlenme olasılığını artıracaktır. GRIN merceğinin çapı ne kadar büyük olursa, fare beynine o kadar fazla zarar verdiğini unutmamak da çok önemlidir; Bu nedenle, uygun boyutu seçmek çok önemlidir. 1 mm çapında bir GRIN merceğinin implante edilmesi, hayvanın doğrusal iz davranışını edinme yeteneğini etkilemez (Ek Şekil S1).

Davranışsal veriler ve kalsiyum görüntüleme verileri genellikle ayrı ayrı işlenir. Fare davranış verileri manuel olarak etiketlenebilir veya açık kaynaklı analiz yazılımı kullanılarak işlenebilir. Kalsiyum görüntüleme verileri, MATLAB'da Rijit Olmayan Hareket Düzeltme (NoRMCorre) ve EXTRACT kullanılarak işlenir. Şekil 6 , görüş alanına üst üste bindirilmiş ekstrakte edilmiş tek tek hücreleri göstermektedir ve başarılı bir in vivo kalsiyum görüntüleme kaydından beş temsili kalsiyum izini göstermektedir. Ham verilerin temsili bir videosu için Ek Video S1'e bakın.

GRIN lens implantasyonu ve viral enjeksiyonun hedeflenen beyin bölgesinde gerçekleştiğinin doğrulanması son adımdır ve verilerin yorumlanması için de çok önemlidir. Şekil 7 , GCaMP6f ekspresyonunun konumunu (yeşil floresan bölgesi) ve GRIN merceğinin izini gösteren bir fare beyni dilimidir.

Şekil 1: Virüs enjeksiyonu ve GRIN lens implantasyonu prosedürlerinin diyagramı. (A) AAV-CaMKIIα-GCaMP6f virüsünü dentat girusa enjekte edin. (B) GRIN lensini dentat girusun üzerine implante edin. (C) Ameliyattan sonra görüntüleme kalitesini kontrol edin. (D) Kontrol ettikten sonra miniskop taban plakasını takın. (E) Tüm protokolün zaman çizelgesi ve süreci. Kısaltma: GRIN = Gradyan indeksi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Virüs enjeksiyonu sırasında temsili cerrahi görünüm. (A) Fareyi stereotaksik cihazın üzerine yerleştirin. (B) GRIN lens implantasyon alanını (siyah bölge) işaretleyin. (C) Hedef bölgede kraniyotomi. (D) Dentat girusa 240 nL virüs enjekte edin. (E) Enjeksiyondan sonra mikropipeti çıkarın. (F) Korteks ve CA1 beyin dokusunun bir kısmını çıkarın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Beyin dokusu aspirasyonu sırasında temsili cerrahi görünüm. (A) Siyah işaretleyici ile çevrelenen bölge, bir mikromatkap kullanılarak parlatılır ve geride (B) kısmen açıkta kalan kortikal doku bırakılır. Sol kısım açıkta kalan bir korteksi gösterir ve sağ kısım dura ve kafatası dokusu ile kaplıdır. (C) Kortikal beyin dokusunun aspirasyonu sırasında temsili görüntü. Doku soluk pembe kalır. (D) Beyaz madde, beyaz okla gösterildiği gibi görüş alanı içinde görülebilir. (E) Daha fazla emme, beyaz maddenin altında koyu gri-kırmızı, yansıtıcı bir yüzey ortaya çıkardı. Bölgenin (siyah ok) CA1 yüzeyi olduğu ve emişin daha derine inmemesi gerektiği düşünülmektedir. (F) Birkaç kez tuzlu su ile duruladıktan sonra bölgeden daha fazla kanama görülmez. Tüm panellerde, yıldızlar cerrahi aletleri gösterir: salin için 30 G künt iğne ve beyin dokusu aspirasyonu için 25 G künt iğne. Ölçek çubukları = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: GRIN lens implantasyonu ve taban plakası bağlantısı için örnek bir prosedür. (A) Bir GRIN lens tutucu kullanarak GRIN lensini beyin dokusuna implante edin. (B) GRIN lensini UV reçinesi ile uygun yere yapıştırın; yansıtıcı kısım UV reçinesini temsil eder. (C) UV reçinesi kullanarak kafa plakasını fare kafatasına takın. (D) GRIN lensini 3D baskılı bir koruyucu kapakla kapatın. (E) Ameliyat kalitesini kontrol edin. Minoskop bir tutucu tarafından sabitlendi. (F) Protez taban malzemelerini taban plakasının etrafına uygulayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Başarılı ve başarısız görüntüleme sonuçları. (A) Başarısız in vivo kalsiyum görüntüleme sonucu. A'da aktif hücre yoktur ve birçok bölgede siyah oklarla gösterildiği gibi koyu kan lekeleri vardır. (B-D) Başarılı in vivo kalsiyum görüntüleme sonuçları. (B) 10'dan az aktif hücre gözlenebilir, ancak görüntüleme alanında önemli kan damarları gözlenemez. (C) 50'den fazla aktif hücre ve önemli kan damarları gözlenebilir. (D) Yüzlerce aktif hücre ve daha önemli kan damarları gözlenebilir. Kesikli daireler görüntüleme görüş alanını temsil eder. Yeşil oklar, GCaMP6f'yi ifade eden hücreleri temsil eder. Kırmızı oklar kan damarlarını temsil eder. Ölçek çubukları = 250 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Doğrusal yolda çalışan bir fareden alınan temsili in vivo kalsiyum görüntüleme verileri. (A) Miniskop tarafından kaydedilen görüntüleme görüş alanı, toplam hücre sayısı = 227. (B) Temsili kalsiyum izleri. Hücrenin konumları A'da aynı renkle gösterilir. (C) Davranışsal görev: Her iki ucunda su ödülleri olan doğrusal parkur. (D) Farenin aktivitesinin davranışsal analizinin temsili sonucu; Toplam süre = 100 sn. Mavi dikey çizgiler, yalama davranışının zaman noktalarını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Ameliyat sonrası farelerden alınan beyin dokusu kesitleri. (A,B) Fare beyin dokularına iki örnek. Kesikli dikdörtgen alanlar, GRIN lens implantasyon yolunu gösterir. Eğri çizgiler, hipokampustaki dentat girusu temsil eder. Ölçek çubukları = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Sorun giderme tablosu. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: Ameliyat geçirmiş fareler tarafından uzamsal hafıza görevinin normal edinimi. Grafik, her gün 20 dakikalık oturumda tamamlanan denemelerin sayısının niceliksel olarak gösterilmesini göstermektedir. Veriler ortalama ± SEM olarak temsil edilir. N = ameliyatlı grupta 3 fare ve ameliyatsız grupta 4 fare. İstatistiksel karşılaştırma için iki yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanıldı. Kısaltma: ns = önemli değil. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S1: DG'de kalsiyum görüntülemenin temsili ham verileri. Bu video, 5 dakikalık bir süre boyunca kalsiyum aktivitesini göstermektedir. Video, orijinal hızın 10 katı hızda oynatılır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Başlık plakasının tasarımı. Bu dosya, başlık plakası tasarımının 2B çizimini ana hatlarıyla belirtir. Başlık plakasının üretimi, çizime göre paslanmaz çeliğin kesilmesini içerir. Kenar çubuğundaki iki küçük deliğe M1.6 dişlerle dokunulmalıdır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: 3D baskılı koruyucu kapağın tasarımı. Bu dosya, bir 3D yazıcı ile kullanılabilecek koruyucu kapak dilimlerinin gcode'unu sağlar. Bu protokolde baskı için hammadde olarak polilaktik asit plastik kullandık. Yandaki küçük delikler, montaj için başlık plakasındaki dişli deliklerin konumlarıyla eşleşir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: Minoskop tutucunun tasarımı. Bu dosya, bir 3D yazıcı ile kullanılabilen miniskop tutucu dilimlerinin gcode'unu sağlar. Silindirik delik, M4 vidalı bir stereotaksik tutucuya montaj için kullanılır. Yandaki deliklerin sıkmak için vida eklemek üzere tasarlanmıştır, ancak tutucu bu özellik olmadan kullanılabilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 4: Ham kalsiyum görüntüleme video ön işleme için Arduino kontrol kodu ve komut dosyaları. Bu dosya, Arduino'yu kontrol etmek için komut dosyalarını ve kalsiyum görüntüleme verilerini ön işleme kodunu içerir. Arduino kodu, farenin doğrusal bir parkurun alternatif uçlarında su ödülleri için yalamayı öğrendiği davranış kurulumunu kontrol eder. Görevi öğrendikten sonra, fareler tekrar tekrar pistte ileri geri koşarlar. Kalsiyum görüntüleme ön işleme kodu, miniskop tarafından toplanan verilerden dosya formatı dönüştürme, hareket düzeltme, uzamsal aşağı örnekleme ve hücre sinyali çıkarma işlemlerini gerçekleştirir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.