Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Summary

Domuz korneasının ex vivo organ kültürü ve epitelyal yara iyileşmesi, kimyasalların oküler toksisitesini test etmek için ekonomik, etik, tekrarlanabilir ve kantitatif bir araç sağlar. Ayrıca, epitelizasyon ve doku onarımının düzenlenmesinin altında yatan mekanizmaların aydınlatılmasına ve diyabetik keratopati ve gecikmiş yara iyileşmesinin tedavisi için terapötiklerin değerlendirilmesine yardımcı olurlar.

Abstract

İnsan gözüne anatomik ve fizyolojik benzerlikleri nedeniyle domuz gözü, biyomedikal araştırmalar ve oküler toksisite değerlendirmesi için sağlam bir model görevi görür. Domuz gözleri kullanılarak hava/sıvı kornea kültürü sistemi geliştirildi ve bu çalışmalar için kritik bir parametre olarak ex vivo epitelyal yara iyileşmesi kullanıldı. Taze domuz korneaları, epitel yarası olsun ya da olmasın organ kültürü için işlendi. Kornealar, MEM’de 37 ° C’de nemlendirilmiş% 5 CO₂ inkübatörinde, test ajanları olsun veya olmasın kültürlendi. Kornea geçirgenliği ve yara iyileşme oranları ölçüldü ve epitel hücreleri ve/veya tüm kornealar immünohistokimya, western blotlama ve moleküler ve hücresel analizler için qPCR için işlenebilir. Bu çalışma ayrıntılı bir protokolü açıklamakta ve bu ex vivo sistemi kullanan iki çalışma sunmaktadır. Veriler, epitelyal yara iyileşmesi ile birlikte domuz kornea organ kültürünün, kimyasal toksisite testi, diyabetik keratopatinin incelenmesi ve potansiyel tedavilerin belirlenmesi için uygun bir ex vivo model olduğunu göstermektedir.

Introduction

Hücre modelleri sınırlı klonal popülasyonlara sahipken ve bir organizmanın in vivo mimarisini yeniden üretemezken, organ kültürü veya eksplant, diğer deneysel modellere göre etik ve fizyolojik avantajlar sağlarken organ fonksiyonu, gelişimi, hastalık mekanizmaları ve potansiyel tedaviler hakkında içgörüler sunar ^1,2. İhtiyaç duyulan hayvan sayısını azaltmanın yanı sıra, kültür eksplantları çevre koşullarını kontrol eder ve mantıklı bir şekilde manipüle eder, bu da bir organ kültürü ortamında hücre çoğalmasını, göçünü, yara tepkisini ve hücresel farklılaşmayı kontrol eden faktörlerin ayrıntılı bir şekilde araştırılması için idealdir ^2,3. Farklı dokular/organlar arasında, insanlarınki de dahil olmak üzere^{kornea eksplantları 4,5,6}, oküler toksisite, tahriş değerlendirmeleri ^7,8, kök hücre fonksiyonunun altında yatan moleküler mekanizmaları^{incelemek 9} ve yara iyileşmesi^10,11 ve Primer açık açılı glokom¹².

Domuz korneaları, insan korneaları ile çeşitli yapısal ve fizyolojik benzerlikleri paylaşır ve bu da onları insan kornea biyolojisi ve hastalıklarını incelemek için mükemmel bir model haline getirir. Yapısal olarak, her ikisi de Bowman katmanına, 5-7 kat epitel hücresine ve benzer eğrilik ve çapa sahiptir. Fizyolojik olarak, oldukça şeffaftırlar, benzer gözyaşı filmi bileşimine ve kornea hidrasyonuna sahiptirler, kornea innervasyonunun karşılaştırılabilir modellerini ve işlevlerini sergilerler ve benzer yara iyileşme süreçlerini takip ederler, bu da onları insan kornea biyolojisi ve hastalıklarını incelemek için mükemmel bir model haline getirir^13,14. İnsan ve domuz korneaları, kollajen fibril düzenlemesi ve su içeriğinde küçük farklılıklara sahip olsa da, bağışıklık sinyalleri ve yanıtları aynı değildir. Bu farklılıklar ksenotransplantasyon için zorluklar doğurmaktadır¹⁵. Bu nedenle, deneysel veriler yorumlanırken türe özgü farklılıklar göz önünde bulundurulmalıdır.

İnsan kornealarıyla karşılaştırıldığında, domuz gözleri et endüstrisinin yan ürünleri olarak kolayca bulunabilmekte, bu da onları uygun maliyetli ve araştırma için kolay erişilebilir hale getirmektedir¹⁴. Domuz kornealarının kullanılması, insan donör kornealarına olan ihtiyacı azaltmaya yardımcı olur ve hayvan testleriyle ilgili etik kaygıları en aza indirir. Ayrıca, aynı anda birçok domuz korneasının mevcudiyeti, güvenilir araştırma sonuçları için çok önemli olan tutarlı ve tekrarlanabilir deneylere izin verir.

Domuz kornea organ kültürü sistemi başlangıçta kozmetik kimyasalların ve oküler ilaçların hayvan testlerinin yerini almak için kullanıldı⁷. Bu sistem, kornea epitel yara iyileşmesini incelemek ve HB-EGF ektodomain dökülmesi, lipid aracı lizofosfatidik asit stimülasyonu ve kornea yara iyileşmesi için EGFR aktivasyonu gibi birkaç önemli sinyal yolunu tanımlamak için kullanılmıştır^16,17. Patolojik bir faktör olarak yüksek glukoz kullanılarak, insan diyabetik keratopatisini taklit etmek için gecikmiş epitelyal yara iyileşmesi ile ex vivo bir hiperglisemi modeli oluşturulmuştur. Bu model kullanılarak, IL-1β’ya karşı IL-1Ra¹⁸ ve TGFβ3’e karşı TGFβ1^19’un denge ekspresyonlarının kornealarda uygun yara iyileşmesi için önemli faktörler olduğu gösterilmiştir ve bu dengelerin manipülasyonu diyabetik keratopatiyi tedavi etmek için kullanılabilir. Bu nedenle, domuz organ kültürü, kimyasal toksisite testleri, biyomedikal araştırmalar, ilaç keşfi ve kimyasal silahlara oküler maruziyete yanıt olarak doku hasarı ve onarımının değerlendirilmesinde çeşitli uygulamalarla ilgili, ekonomik ve manipüle edici bir deney sistemini temsil eder.

Bu makalede, domuz kornea organ kültürünün ayrıntılı bir protokolü anlatılmış ve oküler NSAİİ (NS) göz damlalarının kornea sağlığı üzerindeki potansiyel etkilerini değerlendirmek ve diyabetik keratopatinin patogenezinde rol oynayan sinyal yolaklarını ve biyolojik süreçleri belirlemek için uygulamaları gösterilmiştir.

Protocol

Taze domuz korneaları gıda endüstrisinin bir yan ürünü olduğundan, Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi’nin araştırma için kullanımlarını onaylaması gerekmemiştir. Araştırmada kullanılan insan kornealarının aksine, biyolojik tehlike endişeleri yoktur ve domuz gözlerinin kullanılmayan kısımları normal çöp olarak atılabilir. Bu çalışma için kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Organ kültürü için hazırlık

1. Kullanmadan önce takviye olarak Minimum esansiyel ortama (MEM) penisilin-streptomisin ekleyin.
2. Diyabetik hastalarda hiperglisemiyi taklit ederek 25 mM (450 mg / dL’ye eşit) nihai glikoz konsantrasyonuna ulaşmak için 5 mM glikoz (90 mg / dL’ye eşit) içeren 1 L takviye MEM’e 3.6 g D-glikoz ekleyerek yüksek glikoz kültür ortamı hazırlayın.
3. 20 mL MEM’e 0.2 g agaroz ekleyerek ve agaroz eriyene kadar bir mikrodalgada ısıtarak, 5 mM veya 25 mM glikoz ile takviye edilmiş MEM’de% 1 agaroz hazırlayın.
4. Agaroz içeren çözeltiyi 48 °C’de tutulan bir su banyosuna aktarın.
5. Deneyden önce, damıtılmış su, PBS ve cerrahi ekipman gibi tüm deneysel reaktifleri otoklavlayın: hemostat, forseps, neşter sapı, makas ve trephine’in yanı sıra beherler, kağıt havlular, tüy bırakmayan mendiller, eldivenler ve pipet uçları. Silikon kalıbı, tıraş bıçağını ve bıçak tutucuyu 30 dakika boyunca %70 alkole batırın ve steril PBS ile üç kez yıkayın.

2. Kornea kültürü için domuz göz küresi hazırlığı

1. Yerel bir mezbahadan domuz gözbebekleri alın ve bunları nemli bir odada buz üzerinde laboratuvara taşıyın.
   NOT: Sığır gözleri de benzer şekilde kullanılabilir. Bununla birlikte, sığır gözleri ve kornealar, insan gözlerinden/kornealarından daha belirgin bir şekilde farklıdır. Örneğin, insan ve domuz kornealarında 5-7 kat epitel hücresi bulunurken, sığır kornealarında yaklaşık 20 tabaka^{bulunur 13,14}. Ayrıca, sığır gözlerinin kornea organ kültürü sırasında kontamine olma olasılığı daha yüksektir; Bu nedenle, istatistiksel analiz için daha fazla sığır gözüne ihtiyaç vardır.
2. Domuz gözlerini sterilize edilmiş PBS içeren 1 L’lik bir behere yerleştirin.
   NOT: Domuz gözbebekleri kesimden sonra 1 saat içinde toplanır ve yaklaşık 2 saat içinde laboratuvara taşınır. Genel olarak, gözler 4 saat içinde kullanıldı (adım 2.3).
3. Cımbızla bir göz küresi tutun ve steril bir Petri plakasında bir makasla göz dışı dokuları çıkarın.
4. Göz kürelerini bir kez damıtılmış su ve iki kez PBS ile durulayın.
5. Göz ampullerini 10 saniye boyunca Povidon-İyot antiseptik solüsyonu ile durulayın, ardından sterilize edilmiş PBS’yi üç kez yıkayın.
6. Gözbebeklerini 20 μg / mL gentamisin içeren PBS’de 30 dakika inkübe edin ve PBS ile iki kez durulayın.

3. Epitel yaralanması

1. Sterilize edilmiş tüy bırakmayan mendillerle bir göz küresi tutun ve korneaların merkezini 6 mm’lik bir trephine ile işaretleyin.
2. Trephine işaretli daire içindeki epitel hücrelerini küçük bir neşter veya köşeye köreltilmiş yumuşak tıraş bıçağıyla nazikçe kazıyın, tüm hücre kalıntılarını temizleyin, ancak bazal zarı sağlam bırakın ve yara bölgesini pamuklu çubuklarla temizleyin.
   NOT: Toplanan epitel hücrelerine sahip neşter, buz üzerine yerleştirilmiş bir mikrosantrifüj tüpüne aktarılabilir. Hücreler hemen parçalanabilir veya kontrol görevi görmek için -20 ° C’lik bir dondurucuda saklanabilir.

4. Kornea organ kültürü ve ex vivo hiperglisemi modellemesi

1. Kornea-skleral kenarları bir neşter ve makasla keserek göz küresini inceleyin ve korneaları PBS (pH 7.4) içeren sterilize edilmiş 1000 mL’lik bir beherde durulayın.
2. Eksize edilen korneaları baş aşağı toksik olmayan sıvı kalıp yapıcı silikondan yapılmış steril bir kalıba yerleştirin.
   NOT: Yarım yuvarlak bir kalıp yapmak için 30 mL ultrasantrifüj tüpünün altını kullanarak, toksik olmayan silikon kalıp yapma sıvısını 50 mL’lik bir doku kültürü / test tüpü rafının deliklerine dökün.
3. Endotelyal kornea boşluğunu 48 ° C’de tutulan% 1 agaroz içeren MEM ile doldurun ve karışımın oda sıcaklığında jelleşmesine izin verin.
4. Korneaları ters çevirin ve 35 mm’lik bir tabağa aktarın ve limbal konjonktiva bölgesini kaplamak için merkezi korneanın yüzeyine damla damla test maddesi (ler) ile veya test maddesi olmadan 2 mL MEM ekleyin ve epiteli havaya maruz bırakın (Şekil 1).
5. Kültür kaplarını 37 °C’de nemlendirilmiş% 5 CO₂ inkübatöre yerleştirin ve ortamı 2 gün boyunca günlük olarak test maddesi (maddeleri) olsun veya olmasın taze MEM ortamı ile değiştirin.
6. % 1 agaroz jel hazırlığı ve kültür ortamı olarak kullanılan toplam 25 mM glikoza ulaşmak için MEM’e L-glikoz ekleyerek bir ex vivo hiperglisemi modeli oluşturun.

5. Kornea fonksiyonunun değerlendirilmesi

1. Kalan yara alanını işaretlemek ve fotoğraflamak için yaralı korneaları Richardson boyaması20 ile boyayarak epitelyal yara iyileşme hızını belirleyin (Şekil 2 ve Şekil 3). Image-J veya Photoshop yazılımı (histogram) ile yara boyutunu ölçün.
2. Histoloji, histokimya ve immünohistokimya analizleri için korneaları (Şekil 2 ve Şekil 3) OCT ve kriyostat kesitine gömerek işleyin. Proteinleri ve sinyal moleküllerini (fosforile Erk ve ATK gibi) tespit etmek için TUNEL boyama veya immünohistokimya için bölümleri buz gibi soğuk aseton ile sabitleyin, H & E boyama ile boyayın veya 1 saat boyunca% 1 BSA ile bloke edin.
   NOT: Ticari olarak temin edilebilen antikorların çoğu, domuz antijenleri için test edilmemiştir. Bununla birlikte, bir antikor hem insan hem de fare antijenlerini tanırsa, çoğunlukla karşılık gelen domuz antijeni Western blotlama ve immünohistokimyayı tespit etmek için kullanılabilir.
3. Lekeli korneaları PBS ile yıkayın ve orijinal yarayı işaretlemek ve işaretleyici daireler içindeki epitel hücrelerini kazımak için aynı boyutta trephine kullanın.
   1. Epitel hücrelerini küçük bir neşter ile toplayın, neşteri toplanan hücrelerle birlikte buz üzerinde önceden soğutulmuş bir santrifüj tüpüne batırın.
   2. Toplanan hücreleri -80 °C derin dondurucuda saklayın veya hemen çıkarın ve Western blotting ve/veya ELISA için lizis yapın veya PCR için RNA ekstraksiyon tamponunda (gerekirse)10,16,21.

Representative Results

Discussion

Kültürlenmiş sığır ve çoğunlukla domuz korneaları, kozmetik kimyasalların, glokom ilaçlarının ve steroid olmayan antienflamatuar ilaçların toksisitelerini değerlendirmek için kullanılmıştır^21,26. Domuz korneaları ayrıca insan diyabetik keratopatisinin ex vivo modeli olarak da kullanılmıştır. Tavşan gözlerinden farklı olarak, domuz gözü anatomik, fizyolojik ve biyomekanik olarak insan gözüne ^{benzer 27}, bu nedenle kornea, karaciğer, kalp ve böbrek dahil olmak üzere insan^15’e ksenotransplantasyon için kullanılır. Bu nedenle, domuz korneaları kullanılarak üretilen veriler, insan maruziyeti ile daha alakalı olmalıdır. Ayrıca, domuz gözleri taze, ucuzdur, organ kültürü sırasında mikrobiyal kontaminasyona veya enfeksiyona karşı dirençlidir ve moleküler ve hücresel biyoloji analizleri için nispeten büyük miktarda biyolojik materyal sağlar. Bu nedenle, domuz kornea organ kültürü, biyomedikal araştırmalarda ve kimyasal toksisite tayininde geniş bir uygulama alanına sahip mükemmel bir ex vivo modeldir.

Kültürlenmiş korneaların mikrobiyal kontaminasyondan korunması, bu protokolün başarısı için kritik öneme sahiptir. İyice yıkamaya ek olarak, Povidon-iyot antiseptik solüsyonu ile muamele ve 30 dakika boyunca gentamisin ile inkübasyon, mikrobiyal kontaminasyonu en aza indirmek için önemli adımlardır.

Organ kültürü, dokuların yapısal bütünlüğünü korumasına rağmen, immün ve nöronal unsurlar eksiktir. Bu, ex vivo çalışmaların en büyük sınırlamasıdır. Çoğu durumda, organ kültürü veya eksplant, hayvan çalışmasının tamamlayıcısı olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, kozmetik kimyasalları, piyasaya sürülmeden önce güvenli kullanım ve kullanımları için oküler tahrişi değerlendirmelidir^28,29. 1944’te geliştirilen Draize tavşan gözü tahrişi testi, uzun zamandır göz tahrişini değerlendirmek için altın bir standart olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, istilacı ve üzücü prosedürleri nedeniyle hayvan refahı endişeleri nedeniyle eleştirilerle karşı karşıya kalmıştır³⁰. Hayvanlar üzerinde yapılan deneyler yasaklandı. Kozmetik ürünlerin ve kozmetik bileşenlerin güvenlik ve etkinlik testleri için hayvanlar üzerinde yapılan testlere alternatiflere büyük ihtiyaç vardır. Kornea organ kültürünün, kimyasal maruziyetten sonra kornea epitel geçirgenliği ölçümleriyle birleştirilmesi, in vivo hayvan testlerine mekanik temelli bir alternatif olarak umut vaat etmektedir³⁰. Bu nedenle, bu ex vivo sistemin kullanılması, özellikle kozmetiklerin ve yeni üretilen kimyasalların oküler toksisite ve tahriş açısından test edilmesi için 3R’lerin amacını yerine getirebilir⁸.

Bu ex vivo domuz organ kültürü sistemi, topikal NS’nin potansiyel yan etkilerini karşılaştırmak için de kullanıldı ve ketorolak% 0.45 ketorolak% 0.45 içinde BAK’ın çıkarılmasının, kornea yeniden epitelizasyonu üzerinde önceki ketorolak formülasyonlarına göre istatistiksel olarak daha az etkiye sahip olduğunu gösterdi (% 0.4 ve% 0.5)³¹, bromfenak% 0.09 ve nepafenak% 0.01 (Şekil 2). GİB düşürücü bir ilacın geçirgenliğini artırmak için bir şirket tarafından geliştirilen çeşitli formülasyonlar da kornea toksisitesi açısından değerlendirildi ve hayvanlarda ve / veya hastalarda daha fazla test yapılmadan belirli formülasyonların ekarte edilmesine izin verildi.

Yüksek ve normal glukoz kültürlerini içeren ex vivo modelleri kullanan çalışmalar, diyabetik keratopati ve gecikmiş yara iyileşmesinin fare modellerine tamamlayıcı veriler sağlar (Şekil 3). Bu kombine yaklaşım kullanılarak, HB-EGF ektodomain dökülmesi ve EGFR aktivasyonu^10,16, eksojen lizofosfatidik asit¹⁷ ve TGFβ3, ancak β1^19,32 değil, diyabetik kornealarda gecikmiş epitel yara iyileşmesini hızlandırdığı gösterilmiştir ve bu nedenle diyabetik keratopatiyi tedavi etmek için kullanılabilir. Ek olarak, ex vivo organ kültürü, test edilen bir reaktifin dozajını ve zaman seyrini belirlemek için de kullanılabilir ve daha az hayvanın kullanılacağı in vivo çalışma için deneysel temeller sağlar. Bu nedenle, organ kültürü yapılmış domuz kornealarındaki yüksek glikoz, diyabetik komplikasyonların altında yatan mekanizmaları incelemek ve hiperglisemi ile gecikmiş kornea yara iyileşmesini teşvik etme yetenekleri için reaktifleri test etmek için kullanılabilir^16,17. Şekil 3’te gösterilen sonuçlar, antimikrobiyal peptit LL-37’nin, EGFR ve PI3K’ya bağımlı bir şekilde yüksek glikozun (HG) neden olduğu bozulmuş yara iyileşmesini kısmen azalttığını ve kültürlenmiş domuz kornealarında HG tarafından bozulan EGFR sinyalini geri yüklediğini göstermektedir. Yüksek glikoz koşulları, kültürlenmiş insan kornea epitel hücrelerinde (HCEC’ler) LL-37 ekspresyonunu azalttı. Bu nedenle, LL-37, EGFR sinyalini destekleyen ve hem normal hem de yüksek glikoz koşulları altında epitelyal yara iyileşmesini artıran bir tonik faktör görevi görür. Antimikrobiyal ve rejeneratif özellikleri göz önüne alındığında, LL-37 diyabetik keratopati için umut verici bir terapötik seçenek olabilir. MikroRNA’lar, antioksidanlar, ER stres inhibitörleri ve nekrotoz inhibitörleri gibi diğer faktörler de hipergliseminin kornea sağlığı üzerindeki olumsuz etkilerinin üstesinden gelme yetenekleri ve kornea yara iyileşmesi ve diyabetik kornealardaki kusurları ile ilgili bir yollar ve biyolojik süreçler ağı oluşturmak için bilgi sağlama yetenekleri açısından bu sistemde test edilebilir.

Veziküller gibi yüksek derecede toksik kimyasalların (HTC’ler) kasıtlı veya kazara büyük ölçekli salınımını içeren büyük halk sağlığı acil durumları sırasında ve sonrasında mortaliteyi ve ciddi morbiditeyi azaltmak için tıbbi karşı önlemlerin geliştirilmesine yönelik yenilenmiş bir ilgi vardır 28,29,33. Oküler maruziyet nitrojen hardalı aracı olarak nitrojen hardalı ile ıslatılmış filtre kağıtlarına sahip bu ex vivo domuz kornea kültürü modelinin, doz ve maruziyet süresine bağlı bir şekilde kornea yıkımına neden olduğu gösterilmiştir. DNA alkilasyonu ve çapraz bağlanma, hücre hasarının başlıca nedenleriydi (Yu ve diğerleri, yayınlanmamış). Domuz organ kültürü, insanlarda ve test hayvanlarında çeşitli oküler hasarlara, hatta körlüğe neden olduklarından, silah olarak kullanılan kimyasallarla ilgili bu çalışma dizisi için hayvan modellerine ideal ve tamamlayıcı bir modeldir.

Materials

1.7 mL tubes	Axygen	AXYMCT175SP
Agarose 	Thermo Scientific	R0491
Bromfenac (Prolensa) 0.09% 
Camera	Canon	PowerShot A620
Cell Culture Dish	Corning	430165
D-glucose 	Sigma	50-99-7
Dissecting microscope 	Zeiss	Stemi 2000c
Forceps	FisherScientific	10-316A
Hemostat	FisherScientific	13-812-14
Ketorolac (Acular) 0.45%		Kresge Clinic
Kimwipes	Kimtech	34155
LL-37	Tocris	5213/1
Minimum essential medium (MEM) 	Gibco	A1048901
Nepafenac (Ilevro) 0.1% 
Penicillin-streptomycin 	Gibco	15070063
Phosphate buffered saline	Sigma	P4417
Pig eyes 	Bernthal Packing Inc.
Pipet tips	VWR	76322-164
Porcine corneas	Bernthal Packing , Inc. Frankenmuth, MI 
Povidone-Iodine 	Betadine
Q-Tips cotton swabs	Q-Tips
Razor blade	Electron Microscopy Sciences	72002-01
Razor blade holder 	Stotz
Scalpel	Bard-Parker	377112
Scalpel Handle	Bard-Parker	#3
Scissors	FisherScientific	08-951-20
Silicon mold
Tissue culter enclosure	Labconco	5100000
Trephine	Acu.Punch	3813775
Water bath 	VWR	1235