Farelerde Subklavian Ponksiyon Yoluyla Kalp Kan Toplama

Farelerden kan toplamak, bilimsel araştırmalarda ve çeşitli diğer alanlarda gereklidir¹. Kuyruk ven, femoral ven ve submandibular örnekleme gibi terminal olmayan kan toplama yöntemleri tekrarlanabilirlik avantajları sağlar, ancak doku hasarı, hayvan stresi ve numune kalitesinin bozulması gibi potansiyel riskler^taşır. Terminal işlemlerde, kalp ponksiyonu ve büyük damar kan toplama genellikle büyük kan örnekleri elde etmek için kullanılır ve genellikle toplam kan^{hacminin yaklaşık %50'si 3,4} elde edilir.

Büyük damar kan toplama cerrahi kesi gerektirir ve yüksek kanama riski taşır. Buna karşılık, kalp ponksiyonu minimal invazivdir, hayvan stresini azaltır ve yapılması nispeten kolaydır⁵. Doğrudan kalpten kan toplayarak bu yöntem, hızlı kan akışını sağlar, pıhtılaşma riskini azaltır ve örnek kalitesini artırır⁶. Sonuç olarak, kalp ponksiyonu terminal deneyler için tercih edilen^{tekniktir 7}.

Bu çalışmada kalp ponksiyonu için subklavian yaklaşımı kullandık. Geleneksel delme yöntemlerine kıyasla, bu yaklaşım daha hassas bir iğne yörüngesi sunar. İğne, ardışık olarak deri, deri altı dokusu ve torakal kaslardan geçer, torasik boşluğa girer ve kan toplamak için kalp odasına ulaşır. Örneğin, karın ponksiyonu karaciğer hasarına neden olabilir; bu da serum proteinleri, pıhtılaşma faktörleri ve metabolik enzimler gibi kan^{bileşenlerini değiştirebilir. 8}.

Ayrıca, karaciğer hasarı alanin aminotransferaz (ALT) ve aspartat aminotransferaz (AST) seviyelerinin yükselmesine yol açabilir ve bu da deneysel sonuçları daha da olumsuz etkileyebilir⁹. Pratikte, subklavian yaklaşım özellikle sağlam karaciğer dokusu, karaciğer fonksiyonunun hassas değerlendirilmesi veya protein ile metabolitlerin hassas ölçümü gerektiren deneyler için uygundur. Ancak, anatomik yapıların görselleştirilmesi zor olduğu çok genç veya küçük fareler için ve sağlam kalp dokusu gerektiren çalışmalar için daha az uygundur; çünkü delme sonraki analizleri tehlikeye atabilir.

Bu çalışmadaki tüm hayvan prosedürleri, Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve Çin'de Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Çalışma, hayvan deneyleri için etik düzenlemelere sıkı sıkıya uydu ve Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı (Onay Numarası: YD20250310007). Bu çalışmada toplam 14 sağlıklı C57BL/6 fare (yedi erkek ve yedi dişi) kullanıldı ve vücut ağırlıkları 21 g ile 29 g arasında değişti. Hayvanlar, standart laboratuvar koşullarında Yanbian Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Merkezi'nde barındırıldı.

1. Hayvanlar

1. Son aşamada kalp kan alındıktan sonra, indüksiyon odasında izofluran aşırı dozuyla (%5) solunum durması ve nosiseptif reflekslerin kaybı gözlemlenene kadar fareleri hemen ötenazi yapın. Spontan solunum ve kalp aktivitesinin olmaması nedeniyle ölüm doğrulan.
   NOT: İğneleri dikkatlice kullanın, iğne sapı yaralanmasını önlemek için ve kullanılan tüm keskin silahları hemen belirlenmiş keskin kutulara atın. Biyolojik atık ve hayvan leşlerini belirlenmiş biyolojik tehlike kaplarında bertaraf et.

2. Deneysel hazırlık

1. Deney için şu malzemeleri hazırlayın: 25 G iğneli 2 mL şırınga, %75 etanol, tüp raflı 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri, heparin, düşük sıcaklıklı buz kutusu, elektronik terazi, 4 °C santrifüj, pipet ve pipet uçları.
2. Farelerde kalp kan toplama için, optimal hacm, stabil kontrol, artırılmış operasyonel esneklik ve kan pıhtılaşma riskini azalttığı için 2 mL bir şırınga kullanın.
3. Kan pıhtısını önlemek için şırıngayı heparin solüsyonuyla (0.3 mL, 1.250 U/mL) durulayın.

3. Fare hazırlığı ve konumlandırma

1. Sağlıklı fareleri seçin ve tartın.
2. İzofluran kullanarak inhalasyon anestezisi uygulanır. Faresi bir indüksiyon odasına yerleştirin ve tamamen anestezi edilene kadar %5 izofluran gazına maruz bırakın. Aşağıdaki kriterler karşılandığında anestezi doğrulanın: düzeltici refleksin kaybı, ağrı refleksinin kaybı.
3. İşlem boyunca solunum, renk ve refleksleri takip ederek yeterli anestezi sağlanmasını sağlayın.

4. Delme prosedürü

1. Fareyi sırtüstü pozisyona yerleştirin ve ön uzuvları stabil şekilde çalışma platformuna güvenli bir şekilde sabitleyin (Şekil 1). Toraks bölgesini %75 etanol ile dezenfekte ederek xifoid süreci ve sol köprücük kemiğinin doğru şekilde tanımlanmasını sağlayacak (Şekil 2).
   NOT: Etanol uygularken, solunum sıkıntısına yol açabilecek alkol buharlarının solulmasını önlemek için farenin ağzı ve burnuyla temas kurmaktan kaçının.
2. İğneyi aşağıya doğru tutun.
   NOT: Bu yönelimin temel nedeni, fare sırtüstü pozisyonda sabitlendiğinde operasyonel kararlılığı artırmaktır; böylece kan alımı sırasında iğne hareketini ve örnekleme hatasını azaltır.
3. 2 mL şırıngayı sol köprücük köprücüğün altındaki orta hattan yerleştirin ve iğneyi xiphoid sürecine yönlendirin (Şekil 2 ve Şekil 3).
4. İğneyi ameliyat masasına paralel tutarken 1-1,5 cm derinliğe kadar ilerletin.
5. İğneyin kalp odasında doğru konumunu, şırıngaya darbeli bir kanın geri dönüşünü gözlemleyerek doğrulayın.
   NOT: Operatör, iğneyin çok derin kaymasını veya delmesini önlemek için elini sabit tutmalıdır.

5. Kan toplama

1. İğne doğru konumlandırıldığında, kan toplamak için şırınganın pistonunu yavaşça geri çekin. İğne hareketini önlemek için kan toplama sürecinde elinizi sabit tutun; bu hareketler kan akışını bozabilir.
   NOT: Eğer kan akışı yetersizse, şırınga açısında yapılan hafif ayarlamalar toplanmayı iyileştirmeye yardımcı olabilir. Ancak, deneysel hataları en aza indirmek ve doku hasarı riskini azaltmak için iğneyin sık sık yeniden konumlandırılmasından kaçının.

6. Örnek İşleme

1. Kan örneğini hemen ön hepparinli bir tüpten alın, böylece pıhtılaşmayı önler ve örnek bütünlüğünü korursunuz.
2. Kan örneğini 4 °C'de 15 dakika boyunca 2.000 × g sıcaklıkta santrifüjlenerek plazmayı kan hücrelerinden etkili şekilde ayırın.
3. Santrifüjlemenin ardından, plazma ve kan hücrelerinin net ayrımı için numuneyi inceleyin (Şekil 4A). Örnek koşullarını kaydederek deneysel gereksinimleri karşıladığından emin olun (Şekil 4B).
4. Pipet kullanarak, süpernatantı (plazma) dikkatlice çıkarıp yeni bir tüpe aktarın. Tüpü daha sonraki analiz veya depolama için uygun şekilde etiketleyin.

7. Örnek testi

1. Hazırlanan plazma örneklerini ELISA test kiti kullanarak AST ve ALT seviyeleri için analiz edin.

Bu çalışmada, yedi erkek ve yedi dişi ile 14 C57BL/6 faresi (21-29 g) üzerinde tekrar eden deneyler yaptık. Çalışmalar, yetişkin bir farede tahmini kan hacminin vücut ağırlığı 55 ila 70 mL/kgolduğunu bildirmektedir 10. Seans başına toplanan kan hacmi 700 ila 1.200 μL arasında değişiyor ve toplam dolaşımdaki kan hacminin yaklaşık %50'sini oluşturuyor (Şekil 5). Çalışma süresi oturum başına 60 ila 80 saniye arasında değişiyordu. Toplanan örneklerin hiçbirinde hemoliz veya örnek kontaminasyonu gözlemlenmedi. ALT ve AST plazma seviyeleri ölçüldü (Şekil 6), tüm sonuçlar normal aralıkta (ALT: 30-70 U/L; AST: 50-100 U/L)11. Özellikle, her grupta yedi kişiden biri dişi ve bir erkek ikinci deneme gerektirirken, kalan tüm fareler ilk denemede başarılı bir şekilde numune aldı. Cinsiyetler arasındaki istatistiksel karşılaştırmalar Öğrenci t-testi kullanılarak yapıldı ve cinsiyetler arasında anlamlı farklar gözlemlenmedi. Örneklem büyüklüğü esas olarak subklavian kardiyak ponksiyon yönteminin uygulanabilirliğini ve tekrarlanabilirliğini doğrulamak için seçildi. Ancak, 3R ilkesi (Azaltma, Geliştirme, Değiştirme) altında etik ve düzenleyici değerlendirmelerle belirlenen küçük örneklem büyüklüğü (grup başına n = 7), cinsiyete dayalı karşılaştırmaların istatistiksel gücünü azaltır.

Şekil 1: Anestezi edilmiş fare sabitlenmesi. Farenin ön uzuvlarının sonraki işlemlerde denge sağlamak için doğru stabilizasyonunu gösteren bir resim. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Farelerde subklavian ponksiyon yoluyla kardiyak kan toplama. Şırınga, sol köprücük klavikulasının altındaki orta hatta yerleştirilir ve iğne xiphoid sürecine yönlendirilir. Yerleştirme derinliği 1-1,5 cm arasında tutulur, böylece şırınga ameliyat masasına paralel kalır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kardiyak kan alımı. (A) İğne, yerleştirildikten sonra hafif negatif basınç altında tutulur. (B) İğne kalp odasına doğru yerleştirildiğinde, kan şırıngaya nabızlı bir şekilde girer. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Kan santrifüjü ve plazma ayrımı. (A) Santrifüjlemeden sonra kan örneği farklı katmanlara ayrılır: altta kırmızı kan hücreleri, orta trombosit ve beyaz kan hücresi tabakası, üstte plazma. (B) Ayrılan plazma, dikkatlice etiketlenmiş mikrosantrifüj tüplerine aktarılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Kan toplama hacmi, plazma hacmi, kan hücresi hacmi ve kalıntı kan hacmi ölçümü. Kan alma parametreleri 14 C57BL/6 farede (7 erkek ve 7 kadın) değerlendirildi. Erkekler ve kadınlar arasında kan alma hacminde anlamlı bir fark gözlemlenmedi (P = 0.7042, n = 7). Veriler ortalama SEM ± olarak sunulmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: 14 C57BL/6 faresinde (7 erkek ve 7 dişi) plazma ALT ve AST seviyeleri. ALT-M: ERKEK FARELERDE ALT seviyeleri, dişi farelerde ALT-F: ALT seviyeleri (P = 0.5754); AST-M: ERKEK FARELERDE AST seviyeleri, dişi farelerde AST-F: AST seviyeleri (P = 0.4470). Erkekler ve kadınlar arasında anlamlı farklar gözlemlenmedi ve tüm değerler C57BL/6 fareleri için normal aralık içindeydi (ALT normal aralığı: 30-70 U/L, AST normal aralığı: 50-100 U/L), n=7. Veriler ortalama SEM ± olarak sunulmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.