2.5: İpliksi Mantarlar

1. Toprak Numunesi Hazırlama

1. İlk olarak, bilinen miktarda nemli toprağı gece boyunca kurutarak ve kurumuş toprağı yeniden tartarak toprağın ilk nem içeriğini belirleyin. Toprağın ilk nem içeriğini belirlemek için denklem:
   
   (Denklem 1)
   burada:
   MC = nem içeriği
   W = net ağırlık
   D = kuru ağırlık
2. Toprak nem içeriğini kuru ağırlık bazında% 10'a çıkarmak için 25 g toprağa eklenmesi gereken su miktarını hesaplayın.
3. Daha sonra, bu miktarda suyu 25 g toprağa ekleyin.
4. Kabı streç filmle örtün ve inkübasyon sırasında havalandırmaya izin vermek için filmi bir probla birkaç kez delin. Filmi bir lastik bantla sabitleyin.
5. Toprağı tartın ve sarın, ardından numuneyi bir hafta oda sıcaklığında inkübe edin.

2. Mantar Aşılaması ve Kuluçka

1. Kuluçka tamamlandıktan sonra, toprak numunesini sargı ve lastik bantla tartın. Nem kaybına bağlı kilo kaybını hesaplayın.
2. Yeni toprak nem içeriğini hesaplayın.
3. Ardından, Şekil 2'de gösterildiği gibi toprakların 1/10'luk bir seyreltme serisini hazırlayın. Bu, mL süspansiyon başına 10^-1 (şişe A), 10^-2 (tüp B), 10^-3 (tüp C), 10^-4 (tüp D) ve 10^-5 (tüp E) g toprak seyreltmeleriyle sonuçlanacaktır.
4. Steril Rose Bengal-streptomisin agar plakaları hazırlayın. Hem Gül Bengal hem de streptomisin bakteri üremesini engeller. Toprak mikrobiyal popülasyonlarının yüksek olduğu çok verimli topraklar için, seçilen seyreltmeler daha yüksek olmalıdır, , yani , 10^-3, 10^-4 ve 10^-5, plaka başına g toprak.
5. 10^-3 plakanın her birine, seyreltme tüpü 10^-2'den 0.1 mL ekleyin ve etanol alevi ile sterilize edilmiş bir cam yayıcı kullanarak agar yüzeyine yayın. 0.1 mL'lik bir miktar kaplandığından, bu etkili seyreltmeyi 10^-3 yapar. Tüm dilüsyonlar için bu adımları tekrarlayın.
6. Plakaları bir hafta boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.

3. Koloni sayımı ve mikroskopi ile inceleme

1. Her toprağın bir ve yalnızca bir seyreltilmesinde koloni sayımları yapın. Sayılan plakalar gizli sayılabilir kolonilere sahip olmalıdır. Aşırı büyümüş plakalar sayılmamalıdır. Aynı şekilde 10'dan az kolonisi olan plaklar da sayılmamalıdır. Üç farklı koloninin kültürel özelliklerini not edin ve tanımlayın.
2. Aşağıdaki prosedürü kullanarak ayrıntılı mikroskop çalışması için slaytlar üzerindeki basınç bandı (şeffaf bant) bağlantılarını hazırlayın:
   1. Temiz bir cam kaydırağın ortasına bir damla laktofenol montaj sıvısı bırakın
   2. Stok rulosundan yaklaşık 3 cm uzunluğunda şeffaf bir selofan bant şeridi kesin. Yapışkan yüzeyin kirlenmesini önlemek için, bandı tutarken forseps kullanın. Bir diseksiyon iğnesi, bandın forsepsten serbest bırakılmasına yardımcı olacaktır.
   3. Bandın yapışkan tarafı, sporlanan bir mantar kolonisinin yüzeyine uygulanır. Bant üzerinde aşırı baskı yapmaktan kaçınmaya dikkat edin, aksi takdirde çok yoğun bir hif kütlesi ve sporlar toplanacaktır.
   4. Bandı mantar kolonisi ile temasından çıkarın ve yapışkan tarafı aşağı bakacak şekilde cam slayt üzerindeki montaj sıvısı damlasına uygulayın. Hava kabarcıklarını ifade etmek için bandı pürüzsüz, düz bir aletle nazikçe ovalayın.
   5. Bant montajını, yağ ile yağa daldırma hedefinin altında mikroskobik olarak inceleyin.
   6. Sağlanan mantar tanımlama anahtarını kullanarak iki farklı mantar cinsini tanımlayın (Şekil 4).

Şekil 4. Mantar tanımlama anahtarı.

Filamentli mantarlar, ekosistemde önemli bir rol oynayan, genellikle toprakta çok sayıda bulunan çok hücreli, ökaryotik organizmalardır. Mantarlar izole edilebilir, ölçülebilir ve laboratuvarda incelenebilir.

Mantarlar yüzey topraklarında bol miktarda bulunur ve besin döngüsünde ve organik madde ve kirleticilerin ayrışmasında önemli roller oynarlar. Kendi yiyeceklerini sentezleyemedikleri için heterotrofik olarak sınıflandırılırlar ve aerobiktirler ve bu nedenle oksijene ihtiyaç duyarlar.

Mantarları kültürlemek için, toprak örnekleri bilinen konsantrasyonlarda steril suya seyreltilir, daha sonra agar plakalarına kaplanır ve inkübe edilir. Elde edilen mantar kolonileri daha sonra sayılabilir ve tanımlanabilir.

Bu video, filamentli mantarların izolasyonu, miktarının belirlenmesi ve tanımlanmasının arkasındaki ilkeleri gösterecektir.

Topraklar genellikle gram başına milyonlarca mantar içerir; Bu nedenle, toprak örneklerini analiz için hazırlamak için seri seyreltmeler yaygın olarak kullanılır. Bir dispersiyon çözeltisine belirli bir miktarda toprak eklenir. Süspansiyonun alikotları, süspansiyon ayrı mantar kolonilerinin büyümesine izin verecek kadar seyreltilene kadar seri olarak bir tampon çözeltiye aktarılır.

Bu seyreltmeler daha sonra agar ortamına kaplanır ve inkübe edilir. Görünür mantar kolonileri oluşturduklarında sayılabilirler. Her mantar kolonisinin tek bir organizmadan türetildiği varsayıldığından, Koloni Oluşturan Birimler veya CFU'lar terimi, kuru toprağın gramı başına hesaplanan organizma sayısını ifade etmek için kullanılır.

Çoğu mantar, vejetatif büyümenin ana modu olan uzun, dallanan yapılar olan hifler olarak büyür. Hif kümelenmeleri miselyum olarak adlandırılır. Mantarlar ayrıca tek hücreli organizmalar olarak da bulunabilir ve maya iyi bilinen bir örnektir.

Mantar üremesi birkaç yoldan biriyle ortaya çıkabilir. Hif üreten mantarlar eşeysiz olarak, hifleri parçalayarak veya tohum benzeri sporlara sahip saplardan çoğalabilir. Tek hücreli mantarlar tomurcuklanarak eşeysiz olarak çoğalabilirler.

Mantarlar ayrıca eşeyli olarak da çoğalabilir. Bu, eşeysiz üremeden daha az yaygındır ve genellikle olumsuz çevresel koşullara yanıt olarak ortaya çıkar. Hif üreten mantarlarda, farklı mantar suşlarından iki üreme hifleri birleşerek bir zigot oluşturabilir. Tek hücreli mantarlarda, zıt suşların iki hücresi kaynaşır.

Verimli topraklar normalde kuru ağırlığın gramı başına 106 mantar "propagülü" aralığında içerir. Propagüller mantar sporları, hifler veya hifal fragmanlarıdır. Kültürlenebilir plaka sayımlarının kullanılması, mantar içeriğini aydınlatmak için hızlı, ucuz ve tekrarlanabilir bir tekniktir. Bununla birlikte, sonuçlar, tüm organizmaların ortam plakaları üzerinde kültür yapmayacağı gerçeğiyle çarpıtılabilir.

Streptomisin gibi antibiyotikli gül-Bengal agar plakaları tipik olarak mantar kültürleri için kullanılır. Bakteriler çoğu toprakta mantarlardan çok daha fazla sayıda olduğundan, ideal mantar ortamı, mantarların hayatta kalmasına izin verirken bakteri üremesine karşı seçim yapacaktır. Gül-Bengal boyası çoğu bakterinin büyümesini engeller ve mantar kolonilerinin boyutunu azaltır. Bu idealdir ve bakterileri kontrol etmenin yanı sıra mantar plakalarının aşırı büyümesini önler.

Artık filamentli mantarların kültürlenmesinin ardındaki ilkelere aşina olduğumuza göre, bunun laboratuvarda nasıl yapıldığına bir göz atalım.

Toprak örnekleri toplandıktan sonra, analiz için laboratuvara getirin. İlk olarak, toprağın nem içeriğini hesaplayın. Nem içeriğini% 15'e getirmek için deiyonize su ekleyin.

Kapları streç filmle örtün ve buharlaşmayı sınırlamak için bir lastik bantla sabitleyin. Havalandırmaya izin vermek için filmi birkaç kez delin.

Toprak örneğini ve kabını tartın ve kaydedin. Doğal olarak oluşan mantarların büyümesine izin vermek için oda sıcaklığında bir hafta inkübe edin.

Toprak numunelerini ve kabı yeniden tartın ve ağırlığı kaydedin. Hafta boyunca nem kaybına bağlı kilo kaybını hesaplayın. Ağırlığı orijinal değerine geri getirmek için toprağa su ekleyin.

95 mL damıtılmış suya 10 g nemli toprak ekleyin ve iyice karıştırın. 10 g toprağın hacmi kabaca 1 mL olduğu için bu 5-5 seyreltmedir. Bu stok çözeltisindeki suyu kullanarak 9 mL'lik boşluklara 1 mL'lik dört seri seyreltme gerçekleştirin.

Ardından, sekiz steril Rose-Bengal-streptomisin agar plakası toplayın. Plakalardan ikisine, seyreltme tüpü 10-2'den 0.1 mL ekleyin ve etanol alevi ile sterilize edilmiş bir cam yayıcı kullanarak agar yüzeyine yayın. 0.1 mL'lik bir miktar kaplandığından, bu etkili seyreltmeyi 10-3 yapar.

Bu plakaları oda sıcaklığında karanlık bir dolapta bir hafta boyunca inkübe edin.

Bir hafta sonra, her plakadaki ayrı kolonileri sayın. 10 ila 20 mantar kolonisi olan plakalar sayılmalıdır. Plakaların veya kolonilerin ayırt edici özelliklerini not edin ve açıklayın.

Temiz bir cam mikroskop lamı alın ve merkeze bir damla laktofenol montaj sıvısı bırakın. Kirlenmeyi önlemek için forseps kullanarak, yaklaşık 3 cm uzunluğunda bir şeffaf selofan bant şeridi kesin. Gerekirse, bandı forsepsten kurtarmak için bir diseksiyon iğnesi kullanın.

Bandın yapışkan tarafını, aşırı basınçtan kaçınmaya dikkat ederek sporlu bir mantar kolonisinin yüzeyine uygulayın. Ardından, spor numunesi olan bandın yapışkan tarafını cam slayt üzerindeki montaj sıvısına uygulayın. Hava kabarcıklarını gidermek için bandı pürüzsüz, düz bir aletle nazikçe ovalayın.

Bant montajını yüksek güçlü bir objektif altında inceleyin.

Mantarlar, meyve veren gövdelerin ve sporların incelenmesiyle mikroskobik olarak tanımlanabilir. Bir mantar tanımlama anahtarı bu sürece yardımcı olabilir. Gözlenen yaygın mantar türleri arasında Penicillium ve Aspergillus bulunur.

Plakalar kullanılarak, mantarlar, bakteri sayımı ile aynı teknik kullanılarak numaralandırılabilir.

Mantarların tanımlanması ve kültürlenmesi, çeşitli bilimsel uygulamalar için yararlıdır.

Kağıt hamuru ve kağıt üretim tesisleri gibi endüstriler, biyopulping olarak bilinen bir teknikle, hamurlaştırma işlemlerinde ahşabı bozmak için filamentli mantarlar kullanabilir. Beyaz çürüklük gibi mantarlar, talaşları verimli bir şekilde bozabilir ve bu da kimyasal veya mekanik hamur kullanımına olan ihtiyacın azalmasına neden olabilir.

Mantarlar, belirli biyolojik olarak parçalanabilen plastik türleri de dahil olmak üzere diğer malzemeleri parçalamak için de kullanılabilir. Bu, istenmeyen bitki büyümesine karşı geçici engeller oluşturmak için biyolojik olarak parçalanabilen malç filmlerinin kullanılabileceği tarım veya bahçecilik uygulamaları için yararlı olabilir.

Mantarlar aynı zamanda 20. yüzyılda tıpta devrim yaratan ve bugün enfeksiyonda ön saflarda savunma yapmaya devam eden antibiyotik üreticileridir. Yaygın olarak kullanılan bir antibiyotik olan penisilin, yaygın filamentli mantarlar Penicillium rubens'ten izole edildi. Bu güne kadar, filamentli mantarlar hala izole edilmekte ve yeni antibiyotik arayışında incelenmektedir.

Az önce JoVE'nin ipliksi mantarlarla tanışmasını izlediniz. Artık filamentli mantarları topraktan nasıl kültürleyeceğinizi, bunların nasıl ölçüleceğini ve toprakta yaygın olarak bulunan mantar türlerini nasıl tanımlayacağınızı anlamalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler!