Meme Tümörleri IVIS Spektrum kullanarak in vivo Bioluminescent Görüntüleme

Lusiferaz ifade Meme tümör hücrelerini farelerde subkütan implant ve uzunlamasına bir çalışmada non-invaziv tümör büyümesini ve gelişimini izlemek için optik görüntüleme ile görüntülendi.

Bu prosedüre başlamak için, lusiferaz eksprese eden meme tümör hücre hattı donmuş saplardan çözülür ve daha sonra kültürde% 90 COF akıcılığına genişletilir. Askıda kalan hücrelerin seri seyreltilmesi daha sonra 96 yılında tohumlanır. Luciferian'a maruz kalan kuyu plakaları ve daha sonra 500 fotonun üzerinde floresan emisyonları üreten optimal hücre sayısı bir plaka kullanılarak belirlenir Okuyucu hücreler daha sonra deri altından bir hayvanın yan tarafına enjekte edilir ve ardından lusiferaz enjekte edilir.

İntraperitoneal hücreler, Lucifer uygulamasını takiben 10 dakika kadar erken bir sürede görüntülenebilir ve tümör kitlesi, nekrozun başlangıcına kadar in vivo olarak bir aya kadar görüntülenebilir. Merhaba, ben Alameda, California'daki Caliper Life Sciences'taki Görüntüleme Laboratuvarı'ndan Ed Lim. Bugün size biyolüminesans kullanarak farelerde tümör büyümesini non-invaziv olarak izlemek için bir prosedür göstereceğiz.

Bu prosedür, laboratuvarımızda ve dünya çapındaki ivus laboratuvarında, özellikle ilaç bileşikleri ile tedaviden sonra tümör büyümesi ve gelişimini incelemek için kullanılmaktadır. Öyleyse başlayalım. Bu prosedür, tümör hücre hattının fareye enjeksiyon için hazırlanmasıyla başlar.

Biyolüminesan preklinik deneyler için kanser hücre hatlarını ifade eden çok çeşitli lusiferaz kullanılabilir. Bu hücreler, seçim belirteçlerine ihtiyaç duymadan standart ortamda kolayca büyüyecek olan patojen içermeyen donmuş bir kültür olarak sağlanır. Deneyimiz için, gen ekspresyonunun veya tümör oluşumunun optik bir göstergesi olarak hizmet eden lusiferaz genini ifade eden 41 Luke iki murin meme tümör hücre hattını kullanacağız.

İn vivo, primer tümörün büyümesini non-invaziv olarak izlemek için lusiferaz ekspresyonunu kullanacağız, ancak metastatik lezyonları bulmak ve izlemek için de kullanılabilir. Lusiferaz aktivitesi enjeksiyondan önce doğrulanmalıdır ve bunu yapmak için,% 90'lık bir birleşik şişe tripsin ile hasat edilir ve daha sonra sayılır. 50.000 hücre daha sonra bir mikrotitre plakasının tek bir oyuğuna dağıtılır ve seri seyreltme gerçekleştirilir.

Lucifer, kuyucuklara mililitre başına 150 mikrogram eklenir ve iki dakika inkübe edilir. Mikroplaka, ifade seviyelerini belirlemek için ivus'ta veya ışıldayan bir plaka okuyucuda görüntülenebilir. Bu hücre hattı, hücre başına saniyede 6.500 fotonu ifade eder, ancak hücre başına saniyede 30 fotonun üzerindeki herhangi bir ifade seviyesi, in vivo olarak başarılı bir şekilde görüntülenebilir.

Artık optimal aktiviteye sahip hücrelere sahip olduğumuza göre, deri altı enjeksiyon adımına geçebiliriz. Tümörün optimal tespitini kolaylaştırmak için, A timik immün sistemi baskılanmış bir çıplak fare türü kullanıyoruz. Enjeksiyondan önce, hayvanlar derin anestezi için beş dakika boyunca% 3 ISO flor kullanılarak uyuşturulur.

Daha sonra, yüz mikrolitrelik PBS'de 250.000 hücreyi deri altından yan tarafa enjekte edeceğiz. Hücreleri bir mililitrelik şırıngaya yükleyin ve 26 gauge bir iğne takın. Bir çadır yapmak için cildi forseps ile nazikçe kaldırın ve hücreleri tabana enjekte edin.

Yeni enjekte edilen hücreler hemen görüntülenebilir. Kilogram vücut ağırlığı başına toplam 150 miligram Lucifer daha sonra periton boşluğuna iki enjeksiyon yoluyla uygulanır. Bu çalışmada, tutarlı foton akışı sağlamak için hayvanlar lusiferian enjeksiyonundan 10 dakika sonra görüntülenmiştir.

Bunu size bir sonraki adımda göstereceğiz. Deneyimiz için, maksimum hassasiyet elde etmek için negatif 90 santigrat dereceye soğutulmuş, geri inceltilmiş şarj bağlantılı bir cihaz kullanan IVUS spektrumlu in vivo görüntüleme sistemini kullanacağız. Mutlak kantitasyonu desteklemek için sistem, kesinti sırasında karanlık şarjı ölçer ve başlatma sırasında kendi kendine kalibrasyon yapar.

Görüntülemeyi başlatmak için IVUS sistemini başlatın ve deney için görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Görüş alanını seçin. Görüntülenen hayvan sayısı için, entegre anestezik manifold kullanılarak cihazda en fazla beş hayvan tutulabilir.

Hayvanlarda vücut ısısını korumak için sahne sabit 37 santigrat derecededir. Canlı görüntü yazılımında stresli prosedürler sırasında hayvan sağlığını izlemek için bir EKG portu sağlanmıştır, F-stop süresi ve pix bağlama, hücre hattının ifade seviyesine göre optimize edilebilir. Bu ayarlar, nicel sonucu etkilemeden bir deneme sırasında herhangi bir zamanda değiştirilebilir.

Ivus, görüntünün üzerine bindirilen kantitatif bir biyolüminesan veya flüoresan sinyalde beyaz ışık altında hayvanın fotoğrafik bir görüntüsünü elde eder, biyolüminesan sinyal saniyede foton cinsinden ifade edilir ve bir yoğunluk haritası olarak görüntülenir. Görüntü ekranı, niceliği etkilemeden görüntüde en iyi kontrast ve çözünürlüğü sağlayacak şekilde ayarlanır. Hücrelerden gelen lüminesans, ilgilenilen bir bölge kullanılarak enjeksiyon bölgesinde ölçülebilir. Alet.

Ölçüm verileri, kaydedilebilen veya dışa aktarılabilen görüntü yakalama ile ilgili tüm deneysel parametrelerle birlikte tabloda görüntülenir. Analiz için, birden fazla görüntü elde edilebilir ve karşılaştırılabilir ve deneyin niteliğine bağlı olarak saniyeler veya aylar süren uzunlamasına çalışmalar yapılabilir. Tümörden gelen foton akısını sıfır zamanında ölçeceğiz ve dört hafta boyunca izleyeceğiz.

İki haftalık aralıklarla görüntüleme ile, tümörden gelen foton akışı, lusiferaz eksprese eden canlı hücrelerin sayısı ile orantılıdır. Bu nedenle biyolüminesans, implantasyondan beş gün sonra tümör boyutu ile doğrudan ilişkilidir. Tümör henüz aşikar değildir, ancak hücreler biyolüminesans yoluyla ölçülebilir ve tümörün aktif olarak büyüdüğü görülmektedir.

Bu aşamada, biyolüminesans sinyali çok daha güçlüdür. Pozlama süresi, f-stop ve piksel döndürme, görüntünün net olması ve kameranın doygunluğa ulaşmaması için ayarlanabilir. IVUS, ışık toplamadaki değişiklikleri otomatik olarak telafi eder.

Böylece bu ölçümler daha önce ve daha sonra toplananlarla karşılaştırılabilir. Deneyde. İmplantasyondan 15 gün sonra tümörler aşikar hale gelir ve biyolüminesans ölçümü zaten 15 günlük veri oluşturmuştur.

28. günde, implantasyon sonrası tümörler nekrotik hale gelir ve hücreler ölmeye başlar. Kaliper ölçümü ile tahmin edilen tümör boyutu önemli ölçüde değişmez, ancak tümörden gelen lüminesans azalacaktır. Hücre ölümünün gösterilmesi, kalibre ve biyolüminesans ölçümü, insancıl bir son noktaya ulaşılana kadar devam ettirilebilir.

Hipoksi veya tedavi rejimlerine bağlı tümör nekrozu, tümör kitlesini azaltmasalar bile biyolüminesansın azalması ile gösterilecektir. Biyolüminesan görüntüleme kullanarak basit bir ksenogreft fare modeli olan deri altı tümör gelişimini nasıl izleyeceğinizi gösterdik. Bu prosedürü yaparken, implantasyondan önce hücrelerinizin ifade seviyesini kontrol etmeyi unutmamak önemlidir.

İkinci olarak, maksimum tekrarlanabilirlik için, hayvanları luciferian enjeksiyonundan sonra en uygun zamanda görüntüleyin. Yöntemin hassasiyeti, tümör gelişiminin erken evrelerde izlenmesini sağlar, çünkü tümörler, kaliperler tarafından güvenilir bir şekilde ölçülmeden çok önce biyolüminesans ile ölçülebilir. Her aşamada görüntüleme parametrelerinizi optimize etmeyi unutmayın Bu lüminesans sinyali doygunluğa ulaşmaz, ancak lüminesans ile hayvanlar, remisyon ve nüks etkilerini incelemek için aylarca kantitatif olarak izlenebilir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.