Yetişkin Sıçan Kalp miyositler İlköğretim Kültür

Bu çalışmada, yetişkin sıçan kalp miyositler izole ve kültürü tipik bir şekilde tanımladı. Kollajenaz ve proteaz tek miyositler sindirimi ve izole etmek için kullanılır. Miyositler Çoğu deney gereksinimlerini karşılamak bu protokolü takip kültürü.

Prosedür, kalbin yetişkin bir sıçandan çıkarılması ve perfüzyon sistemine asılmasıyla başlar. Enzim çözeltilerinin yaklaşık 30 dakika perfüze olmasına izin verilir, ardından kalp çıkarılır. Kıyılmış ve enzimatik sindirim küçük bir beherde devam etmesine izin verilir.

Sindirimin sonunda, hücreler mekanik çalkalama ile tek hücreli bir süspansiyona ayrılır ve steril bir tüpe süzülür. Primer kalp hücreleri, kalsiyum konsantrasyonu artan tamponlarda üç kez yıkanır, kültürde, besiyerinde yeniden süspanse edilir ve laminat kaplı doku kültürü kapları üzerine kaplanır. Merhaba, ben Columbia Üniversitesi Fizyoloji ve Hücresel Fizik Bölümü'nde Henry Cowa'nın laboratuvarından Shahi

Bugün size diğer sıçan kalp hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda kalpteki kalsiyum kanallarını incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Sıçan ameliyatından bir gün önce tüm solüsyonların yapıldığından emin olun, ancak henüz herhangi bir enzim eklemeyin. Tampon a, B ve yıkama tamponunun tümü, dört santigrat derecede depolamadan önce sterilite açısından filtrelenmelidir. Altı kuyucuklu doku kültürü plakası da bir gün önce laminat solüsyonu ile kaplanmalı ve bir CO2 inkübatöründe 37 santigrat derecede saklanmalıdır.

Ameliyat günü. Kelepçe, makas ve forsepsleri %70 etanol ile dezenfekte ederek cerrahi aletleri hazırlayın ve bir kağıt havlu üzerinde kurumaya bırakın. Yarım mililitre heparin çözeltisi ile doldurulmuş bir mililitrelik bir şırınga hazır hale getirilir.

Şimdi% 70 etanolden geçen perfüzyon aparatını peristaltik pompa ile ters yönde yıkamak iyi bir uygulamadır. Bittiğinde, etanol ile durulayın, cihazı çift damıtılmış su ile durulayın ve son olarak tampon A ile durulayın. Akış bir beherde toplanır ve 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirilir. Temizlenmiş füzyon aparatını hazırlamak için, sağ şırınga tüpünü 40 mililitre tampon A ile ve sol şırınga tüpünü 40 mililitre tampon B ile doldurun.

Tamponu bir şırıngayı 40 mililitre seviyesine kadar doldurun. Bu adımdan sonra tüpte sıkışmış hava kabarcığı olmadığından emin olun, şimdi tamponu, stop musluğu valfli bir şırıngayı kapatın ve işlemi, füzyon tüpü şimdi tampon B ile astarlanacak şekilde tekrarlayın. B stop musluğu vanası açık, ancak akış durduruldu.

IV hattındaki regülatörü kullanarak, toplama kabındaki tampon akışını atın. Ameliyattan önce yapılacak son şey, gerekli enzimleri stok solüsyonunuza eklemek ve ardından enzim solüsyonunu tıpkı diğer solüsyonların bir gün önce filtrelendiği gibi filtrelemektir. Filtrelendikten sonra, bu çözelti standart protokole göre oda sıcaklığında bırakılabilir.

Fareyi bir gaz odasında izo flor ile ötenazi yapın. Göğüs kafesindeki kesi bölgesini %70 etanol ile sterilize edin. Makas kullanarak göğsü açın ve kalbi ortaya çıkarın.

Sol ventriküle 0.5 mililitre heparin çözeltisi enjekte edin. Aortun büyük bir kısmı sağlam olan kalbi çıkarın. Kateteri hemen aort içine yerleştirin.

Tipik bir sıçan kalbi, sağlıklı çubuk şeklindeki miyositlerin yüksek bir kısmını ve birkaç ölü yuvarlak hücreyi vermelidir. Aşağıdaki prosedüre uygun şekilde uyulursa, aortu katetere klemplemeye başlamak için. Kalbin koroner arterden iyi bir şekilde perfüzyonunu sağlamak için kateterin ucu kalbe çok fazla itilmemelidir.

Kemplendikten sonra aortu dikişle katetere bağlayın. Ardından, hızlı bir damlama hızına izin vermek için IV hat regülatörünü açın ve tampon arı yıkaması sırasında tampon arının kalbi yıkamasına izin verin. Kulakçıkları ve kalbe yapışan yağ veya akciğer dokusunu çıkarmak için küçük makas ve forseps kullanın.

B arabelleği bittikten sonra, akışı bir süre arabelleğe almak için değiştirin. Tampon A'nın beş dakika boyunca akmasına izin verilir. Enzim çözeltisini 37 santigrat derece su banyosunda ısıtın.

Tampon A şırıngadan boşaldığında, ancak yine de tüpte mevcut olduğunda, füzyon aparatının şırınga A'sındaki 50 mililitre enzim çözeltisi yükleyin. Şimdi, enzim çözeltisi kalbi inceleyene kadar su banyosundaki toplama kabından gelen tüm akışı atmak gerekiyor. Enzim çözeltisi kalbi inceler incelemez, enzim çözeltisini toplama kabından doldurulmuş şırıngaya aktarmak için ayarlanmış olan peristaltik pompayı etkinleştirin.

A enzim çözeltisinin 10 dakika boyunca kalpten akmasına izin verin. Kalp sindirilirken, etkili bir 0.1 milimolar kalsiyum konsantrasyonu vermek için şırınga A'daki enzim çözeltisine 37.5 mikrolitre 0.1 molar kalsiyum klorürde şişkin görünmeye başlar. Bu, 10 dakika sonra konsantrasyonu arttırmak, şırınga A'ya 50 mikrolitre 0.1 molar kalsiyum klorür ekleyerek kalsiyum konsantrasyonunu 0.2 milimolar'a çıkarmak ve bolluğun 10 dakika daha ilerlemesine izin vermek için kullanılan birkaç kalsiyum klorür ilavesinin ilkidir.

10 dakika geçtikten sonra, ventrikülleri kesin ve kalbi, beherde 20 mililitre enzim çözeltisi içeren küçük bir steril behere aktarın. 40 mikrolitre daha 0.1 molar kalsiyum klorür ekleyerek kalsiyum konsantrasyonunu 0.4 milimolar'a yükseltin, kalbi bir çift küçük steril makasla 10 veya daha fazla parçaya hafifçe kıyın. Şimdi beheri 37 santigrat derecede hafifçe sallayarak inkübe edin.

Beş dakikalık inkübasyondan sonra, etkili bir 0.6 milimolar kalsiyum konsantrasyonu elde etmek için 40 mikrolitre 0.1 molar kalsiyum klorür ekleyin ve 37 santigrat derecede beş dakika daha inkübe ettikten sonra kalp parçalarını plastik bir transfer pipeti ile üç ila beş kez nazikçe yineleyin, 40 mikrolitre 0.1 molar kalsiyum klorür ekleyin ve daha önce olduğu gibi hafifçe yineleyin. Sindirilmiş tek miyositleri sindirilmemiş bağ dokusundan ayırmak için steril bir 500 mikrometre filtre kullanın. Hücrelerin oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 50 mililitrelik bir tüpe yerleşmesine izin verin, sarsıntılı süpernatanı bir transfer VI ile atın: Hücreleri bir numaralı yıkama tamponunda nazikçe yeniden süspanse edin ve hücrelerin oda sıcaklığında 10 ila 20 dakika oturmasına izin verin. hücreler çökelirken.

Küçük bir alikot alın ve bu zamanı ters çevrilmiş bir mikroskop altında süspansiyon halindeki hücrelerin kalitesini ve canlılığını değerlendirmek için bir fırsat olarak kullanın. İyi bir preparat, keskin çizgilere sahip yüksek oranda çubuk benzeri hücrelere sahip olacaktır. Hücreler yerleştikten sonra, snat'ı atın ve hücreleri yıkama tamponunda nazikçe yeniden süspanse edin.

İkincisi, hücrelerin oda sıcaklığında yerleşmesine izin verin, bu da yine 10 ila 20 dakika sürmeli ve süpernatanı atmalıdır. Hücreleri doku kültürü plakalarına aktarmadan önce hücreleri% 5 serum ortamında nazikçe yeniden süspanse edin. Plakaları bir XSFM ile yıkayın.

Hücreleri istenen yoğunlukta aktarın ve bir CO2 doku kültürü inkübatöründe inkübe edin. Üç ila beş saat boyunca, ortamı bir XSFM Hücresine geçirin ve dört güne kadar kültürlenebilir ve deneyler için gerektiği gibi kullanılabilir. Protokol doğru yapıldığında inverted mikroskop altında %70'den fazla canlı kalp miyositi bulunmalıdır.

Bunlar 48 saat kültürlendikten sonra YFP REM ile transfekte edilen izole miyositlerdir. Bu kalitedeki hücreler tipik olarak bu prosedürden kültürlenir. Size sadece nasıl izole edileceğini göstereceğiz ve kültür o kadar sıcak hücrelerdir.

Bu prosedürü yaparken, mümkün olduğunca hızlı ve temiz olmayı unutmamak önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.