Name: Yetişkin Zebra balığı Tüm Böbrek İliği Nakli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Keşfedin yetişkin Danio rerio'da hematopoietik hücre nakli yöntemini. Bu teknik kök hücre farklılaşmasını ve kan hücresi gelişimini in vivo ortamda araştırmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Işınlama <ol><li> Transplantasyon öncesi 25Gy 2 gün ışın tedavisi WT balık </li></ol> Böbrek diseksiyonu <ol><li> Tricaine (~ 100ml 4mg/ml Tricaine balık su / litre) (500.000 hücreler donör balık başına ortalama) uygun sayıda floresan donörlerin Kurban </li><li> 0.9X PBS +% 5 FCS +% 1 Penn strep (PBS + &quot;) tüp içine böbrek Isolate </li><li> 18 1 / 2 G iğne ile, daha sonra 10 ml şırınga ile 1 ml pipetlemeyin Break ile </li><li> Konik 50ml içine aktarın ve PBS ile doldurmak + </li><li> @ 1500rpm 8dk aşağı Spin </li><li> 40micron filtresi aracılığıyla geniş hacim ve filtre, tekrar süspansiyon pelet dökeceğim </li><li> @ 1500rpm 8dk aşağı Spin </li><li> 1ml PBS içinde tekrar süspansiyon, dışarı dökün +, Eppendorf tüpüne transfer </li><li> Saymak için: 10ul hücre sol + 90ul tripan mavi (şimdi 10X seyreltilir) </li><li> 10ul hücre sol + 90ul PBS + (şimdi seyreltilir 10X) </li><li> Hemasitometre her iki tarafında her iki 10ul sol ekleyin, 5 dakika bekletin </li><li> Ölüm oranı büyük bir kutu (5x5), hesap hücre sayımı önemli. </li><li> Hücre / ml = (hücre sayısı) (10 4) (x10 dil faktörü) Örnek - 60 hemasitometre sayılır hücrelerinin toplam 6.000.000 hücreleri </li><li> Örnek @ 1500rpm aşağı Spin 8dk </li><li> Uygun hücre konsantrasyonu elde etmek için tekrar süspansiyon pelet giriş hacmini </li><li> 3ul WKM ve 2ul olan periferik kan enjekte etmek 5ul toplam hacmi </li><li> Örnek - 6.000.000 hücrelerinin toplam alıcı başına 200.000 hücre nakli için 20 alıcı var 66.667 hücre / ul (200.000 hücre / 3ul) istiyor 90ul tekrar süspansiyon pelet (6.000.000 hücre / 66.667 hücre / ul) Sadece bunun 60ul hakkında gerekli (20recip x 3ul) </li></ol> Periferik kan emme <ol><li> Tricaine (~ 100ml 4mg/ml Tricaine balık su / litre) WT balık taşıyıcı kan (donör ortalama 2.000.000 hücreleri ortalama) uygun sayıda Kurban </li><li> Antikoagülan: 1ml PBS seyreltik 1ul (3unit/ul) + </li><li> Heparin ile Coat pipetlemeyin ucu, pipetlemeyin ucu ile solungaç üzerinden bıçak, PBS kan + </li><li> Spin 1.5mL içinde tekrar süspansiyon 1500rpm 5min </li><li> Spin 1ml içinde tekrar süspansiyon 1500rpm 5min </li><li> 40micron filtre süzülür </li><li> Yukarıdaki gibi hücre sayımı </li><li> Hücre / ml = (hücre sayısı) (10 4) (x10 dil faktörü) </li><li> Hesap ölüm </li><li> Tabanda hacmi yukarıdaki gibi hesaplayın </li></ol> Enjeksiyon <ol><li> Hamilton şırınga kullanarak her alıcı kalp içine enjekte 5ul </li><li> Nemli bir sünger tricaine balık (4.2ml (4mg/ml) Tricaine / 100ml balık su) ve yer anestezisi </li><li> Kalp arkasında küçük bir ipucu Ekle </li><li> Kan küçük bir patlama (kalp vurmak anlamı) görene kadar kalp alanı çevresinde Poke -&gt; görüyorum ama yine de enjekte değil Olabilir </li></ol> Balık ICU - enjeksiyon sonrası <ol><li> Enfeksiyonu önlemek için, 1 hafta boyunca akış kapalı balık tutun </li><li> Kafes ortalama 5-10 balık koyun </li><li> Ölü çıkarın ve kaydını tutmak </li><li> El ile her gün su değişimi </li></ol>

yetişkin zebra balığı tüm böbrek İliği nakli

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoetik kök hücrelerin (HSC) bir organizmanın hayatı boyunca tüm farklılaştırılmış kan soy korumak pluripotent hücreler nadir bir nüfus. HSC işlevsel tanımı sulandırmak ışınlanmış bir alıcı, uzun vadeli tüm kan soy yeteneği olan bir nakledilen hücre. Bu atama memeli sistemlerinde seminal çalışma yıllardır tarafından kurulmuştur. Hematopoetik hücre transplantasyonu (HCT) ve fareyi ters genetik manipülasyonları kullanarak, HSC biyolojinin temel düzenleyici faktörleri açıkladı başlıyor, ama hala büyük ölçüde altında incelenmiştir. Son zamanlarda, Zebra balığı omurgalı hematopoez çalışmak için güçlü bir genetik model olarak ortaya çıkmıştır. Zebrafish içinde HCT kurulması bilim adamları HSC yönetmelik altında yatan yeni mekanizmalar ortaya zebrafish mevcut büyük ölçekli genetik ve kimyasal tarama metodolojileri kullanmak için izin verecektir. Bu makalede, biz yetişkin zebrafish HCT gerçekleştirmek için bir yöntem ortaya koymaktadır. Biz zebrafish tüm böbrek iliği diseksiyon ve hazırlık zebrafish yetişkin hematopoez site, bu donör hücreleri ışınlanmış alıcı balık intrakardiyak enjeksiyon yoluyla dolaşıma giriş ve göstermektedir. Ayrıca, uzun vadeli sağlık artırmak için bir &quot;YB&quot; balık nakil sonrası bakım açıklar. Balık genel, nazik bakım öncesinde, esnasında ve sonrasında nakli, uzun vadeli değerlendirme (&lt;3 ay) engraftman için gerekli bir aydan fazla Aşağıdaki prosedür, hayatta balık sayısını artırmak için kritik öneme sahiptir. Bu protokol kurmak için kullanılan deneysel veriler başka bir yerde ilan edilecektir. Bu protokolün kurulması, büyük ölçekli zebrafish genetik ve nakli biyoloji birleşme için izin verecektir.

Yetişkin Zebra balığı Tüm Böbrek İliği Nakli

Hematopoetik kök hücreler (HKH), bir ... boyunca tüm farklılaşmış kan soy hatlarını sürdüren, nadir bir plüripotent hücre popülasyonudur.

Benim adım Jocelyn Blank. Lauren Z'nin laboratuvarında teknisyen olarak çalışıyorum ve zebrafishlerde hematopoez üzerine çalışmalar yürütüyorum. Özellikle hematopoez hakkında daha fazla bilgi edinmeye çalışıyoruz.Bu, genel bir hematopoiez şemasıdır. Süreç, kendini yenileyebilen ve kısa süreli bir kök hücre oluşturabilen uzun süreli bir meta kök hücre ile başlar; bu kısa süreli kök hücre de daha sonra lenfoid bir progenitör ve miyeloid bir progenitör olan öncül hücreleri oluşturabilir. Ardından bunlar sırasıyla lenfoid veya miyeloid hücreleri oluştururlar.Dolayısıyla, HSC'lerin daha sonra farklılaşmış hücreleri oluşturan öncül hücreleri nasıl ürettiğinin başlangıç kısmıyla oldukça ilgileniyoruz. Transplantasyondan iki gün önce yabanıl tip balıkları 25 gray radyasyonla ışınlıyorum. Böylece temiz bir sisteme sahip oluyoruz ve floresan transgenik donörlerden gelen donör iliğini transplant edebiliyoruz; bu sayede transplant ettiğimiz hücreleri izleyebilir ve kanı yeniden populate edip edemediklerini görebiliriz. Transplantasyon gününde, uygun sayıda floresan donörü sakrifiye edip trikan hazırlıyorum.Solungaçların artık hareket etmediğini görene kadar bekleyin. Ardından balığı şu şekilde bir kaba veya platforma yerleştirin; karnının hemen altına küçük bir kesik atın ve ardından makası yerleştirerek karnını boydan boya kesin. Bu mu? Evet, şimdi buraya kadar tamamen kesildi ve balığı bir şekilde açık tutun.Ardından diğeriyle, diğer organı çıkarın. Böbrek, balığın sırtı boyunca yer alır. İyi olan pensetimi alıp üst kısmından yakalayabilirim, ardından aşağı doğru soyarak oradaki parçayı sıyırıp tüpe koyabilirim; şimdi onu konik bir tüpe aktarıyorum ve yukarı aşağı hareket ettiriyorum.Böbrek parçalarını ayrıştırmak için 10 mL'lik bir şırınga ve 18,5 gauge iğne kullanarak parçalama işlemini gerçekleştireceğiz; ardından bir tüpe aktarıp PBS çözeltisi ile dolduracağız. PBS içinde süspansiyon elde etmek için 5.000 RPM'de santrifüjleyin veya bir mikron hücre süzgeci kullanın. Süzgeçle süzerek mevcut büyük parçaları yakalamak istiyorum.Resus süspansiyonunu 1 mL PBS içine dökün ve hücreleri sayın. Nakledilecek hücre sayısını hesaplayın, balığı sakrifiye edin ve tri-coat uygulayın, pipet ucunu heparin ile kaplayın. Pipet ucuyla solungaçtan batırın ve kanı PBS çözeltisine ekleyin.Santrifüjleyin, resüspande edin, yeniden askıya alın ve tekrar santrifüjleyin. 40 mikronluk filtreden süzün ve tüm böbrek iliğinde olduğu gibi hücreleri sayın. Şırıngada kabarcık kalmadığından emin olarak, şırıngayı 5 µL hücre ile dolduracağım.Balıklar enjeksiyondan önce trica ile anesteziye alınacaktır. Enjeksiyon için, bir Hamilton şırınga kullanarak her bir alıcının kalbine beş mikrolitre tüm böbrek iliği ve periferik kan çözeltisi enjekte edin. Ardından şırıngayı biraz geriye doğru yerleştireceğim.Kalp yaklaşık olarak burada, bu yüzden varmak istediğim nokta burası. Çok yüzeysel kalarak iğneyi batıracağım. Ardından kalbin bulunduğu tam bu bölgede etrafı yoklayacağım.Ve bazen, kalbe ulaştığınız anlamına gelen bir kan fışkırması görürsünüz. Bazen de görmezsiniz. Herhangi bir kan görmüyorum, bu yüzden sadece enjeksiyonu yapacağım.İşlem bu kadar. Enfeksiyonu önlemek için balıkları bir hafta boyunca akıntıdan uzak tutun. Her kafeste yaklaşık beş ila 10 balık bulundurun, ölüleri her gün temizleyin ve suyu her gün manuel olarak değiştirin.Böylece böbrek iliği, kök hücrelerin bulunduğunu ve burada soylarını oluşturduklarını düşündüğümüz yerdir. Bu yönüyle insanlardaki kemik iliğine benzer. Dolayısıyla, insanlarda kemik iliği implantları yaptığımızda, onları hayvanın kalbine naklettiğimizde de tamamen aynı mantık geçerlidir.Şimdi, farklı yöntemler denedik. Hücreleri dolaşıma sokmanın en etkili yolu budur. Böylece kemik iliği, HSP'nin tüm proteinlerini oluşturabildiği yerdir.Böylece HSE'ler böbrek iliğine ulaşmanın bir yolunu bulmalıdır ve bunu dolaşım yoluyla gerçekleştirebilirler. Eğer iliğin yeniden popülasyonunu sağlarsak, uzun süreli bir hemato kök hücre naklettiğimizi anlarız; çünkü yeniden popülasyon yapabilen ve tüm bu hücreleri oluşturabilen tek hücre budur. En çok ilgilendiğimiz konu da budur.Bu yüzden, kesinlikle gerçek enjeksiyonların çok fazla pratik gerektirdiğini söyleyebilirim, birçok balık ölecektir. Temel olarak, her zaman emin olamadığınız ve görmesi oldukça zor olan kalbe ulaştırmaya çalışmakla ilgilidir. Ayrıca, enjeksiyon sırasında balığı öldürmemeye çalışmak da önemlidir.Enjeksiyon yaparken diğer iç organlara denk gelebilirsiniz, bu da ölüme yol açabilir veya balıklar enjeksiyondan sonra enfeksiyon kapabilir. Bu yüzden bir şey deniyoruz; genellikle balıkların çoğu enjeksiyondan bir gün sonra ölmektedir. Dolayısıyla şu an her şeyi mümkün olduğunca steril tutmaya çalışıyoruz, balıkları akıntıya, yani sistem suyuna geri koymuyoruz çünkü bu şekilde sudan enfeksiyon kapabilirler.Bu nedenle onları ayrı tutuyoruz, sularını her gün değiştiriyoruz ve transplantasyon sonrası kritik dönemde daha sağlıklı kalmalarını sağlamak için suya antibiyotik eklemek gibi önlemler düşünüyoruz. Bu yöntemi mutantları çalışmak için kullanabiliriz. Eğer bir mutantın kök hücrelerinde bir defekt olduğunu düşünüyorsak, onlardan alınan iliği yabani tip balıklara nakledebiliriz.Veya bu balıklara yabani tip iliği nakledebilir ve kök hücrelerin kendilerinde mi yoksa kök hücre nişinde mi bir sorun olduğunu görebiliriz. Eğer kök hücreler herhangi bir nedenle böbrek iliğine giden yolu bulamıyorsa, bu bir sorun teşkil edecektir. Böylece, balığın greft tutup tutmadığına bakarak bunu ölçebiliriz.

transplantation-of-whole-kidney-marrow-in-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada yetişkin zebrafish retroorbital enjeksiyon nasıl yapılacağını göstermektedir.

Yetişkin Zebra balığı retro-orbital Enjeksiyon

Hücre nakli, doku rejenerasyonu çalışmak için ve hücre tabanlı tedaviler hastalığın geliştirilmesi için önemli bir tekniktir. Biz burada yetişkin Zebra balığı balık böbrek doğrudan genetik etiketli hücrelerinin nakli izin veren bir mikrocerrahi tekniğini göstermektedir.

Doğrudan Yetişkin Zebra balığı Böbrek Hücre Nakli

Zebrafish böbrek, her iki böbrek ve hematopoetik yetişkin kök / progenitör hücrelerin ev ve bu omurgalı bir model organizmadaki hücre tipleri ve onların soyu incelemek için olağanüstü bir fırsat teşkil etmektedir. Burada, yetişkin zebrafish böbrek hücre izolasyonu, nakli, böbrek ve / veya kan hücre popülasyonlarının ifade çalışmaları gibi uygulamalar için de kullanılabilir belirlemek ve cerrahi kaldırmak için araştırmacı sağlayan ayrıntılı bir diseksiyon prosedürü göstermektedir.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek diseksiyonu

Zebra balığı yetişkin böbrek böbrek yenilenmesi ve hastalık çalışmalar için mükemmel bir sistemdir. Böyle bir araştırmanın önemli bir yönü nefron yapısı ve fonksiyonu değerlendirmesidir. Bu protokol nefron borucuk kompozisyonunun ve böbrek geri emiliminin değerlendirilmesi için uygulanabilecek çeşitli yöntemler anlatılmaktadır.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek Nefron Kompozisyon ve Fonksiyon Analizi

Burada, gentamisin enjeksiyonu ile akut böbrek hasarını indükleyerek erişkin böbrek rejenerasyonunu incelemek için güvenilir bir yöntem sunuyoruz. Yaralanmanın gentamisin dozajına ve çevre sıcaklığına bağlı olduğunu, lhx1a+'yı etiketlemek için yerinde hibridizasyon kullanarak, yeni nefronlar geliştirdiğini gösterdik.

Gentamisin Kaynaklı Sakatlık tarafından Yetişkin Zebra balığı Böbrek Rejenerasyon

Burada, zebra balığı iskelet kası ve embriyonal rabdomiyosarkomun (ERMS) erişkin bağışıklık sistemi baskılanmış rag2E450fs homozigot mutant zebra balığına hücre nakli için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, kas hücrelerinin rejenerasyonu ve malign dönüşümünün verimli bir şekilde analiz edilmesini sağlar.

Bağışıklık Aşılmasına Yetişkin Zebra balığı içine normal ve malign Kas Hücre Nakli

Kanser hücrelerinin transplantasyonu, kanser mekanizmalarının ve terapötik tepkilerin tanımlanması için önemli bir araçtır. Mevcut teknikler, bağışıklık yetersiz hayvanlara bağımlıdır. Burada, tümör hücresi davranışının ve in vivo ilaç yanıtlarının uzun vadeli analizi için immün yetkin embriyolara zebra balığı tümör hücrelerini nakletmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Zebra balığı Pediatrik Beyin Tümörlerinin Tümör Hücre Davranışının ve İlaç Yanıtının Uzun Vadeli İncelenmesi için Bağışıklık Yetenekli Ev Sahibi Olarak Transplantasyonu

Bu protokol, cisplatin'i nefrotoksik ajan olarak kullanarak yetişkin zebra balıklarında Akut Böbrek Yaralanmasına (AKI) neden olacak prosedürleri açıklar. Renal dokuda inflamasyon ve hücre ölümünü analiz etmek için tekniğin tekrarlanabilirliğini ve iki tekniği değerlendirme adımlarını, akış sitometrisini ve TUNEL'i ayrıntılı olarak detaylandırdık.

Yetişkin Zebra Balıklarında Cisplatin tarafından İndüklenen Akut Böbrek Yaralanması Modeli

Hücrelerin ekstirpasyonu ve nakli gibi embriyolojik manipülasyonlar erken gelişimi incelemek için önemli araçlardır. Bu protokol, zebra balığı embriyolarında bu manipülasyonları gerçekleştirmek için basit ve etkili bir transplantasyon cihazını tanımlar.

Zebra Balığı Embriyoları İçin Basit ve Etkili Bir Transplantasyon Cihazı

Burada, zebra balığı embriyolarında ve larvalarında döllenmeden en az 1 ila 7 gün sonra herhangi bir aşamada yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip hücrelerin nakli için bir protokol sunuyoruz.

Embriyonik ve Larva Zebra Balıklarında Yüksek Çözünürlüklü Hücre Nakli

Burada, yetişkin zebra balıklarına hücrelerin veya farmakolojik ajanların intravenöz enjeksiyonu için optimize edilmiş ve etkili bir protokol sunuyoruz, bu da hücre aşılamasının artmasına ve tedavi edilen zebra balığının hayatta kalma oranlarının artmasına neden oluyor.

Yetişkin Zebra Balıklarında Optimize Edilmiş İntravenöz Enjeksiyon

Keşfedin yetişkin Danio rerio'da hematopoietik hücre nakli yöntemini. Bu teknik kök hücre farklılaşmasını ve kan hücresi gelişimini in vivo ortamda araştırmak için kullanılır.

Yetişkin Zebra balığı Tüm Böbrek İliği Nakli

Daha fazla video keşfet