Civciv Ex ovo Kültür ve Ex ovo CAM Testi: Gerçekten Nasıl Çalışır?

Civciv chorioallantoic membran (CAM), anjiyogenez ve tümörogenez çalışmak için eşsiz bir doğal bağışık yetmezliği olan, destekleyici bir kültür ortamı. Bu video makale piliç farklı adımları gösteriyor. Ex ovo Kültür, potansiyel anjiyogenik maddeler ve CAM yüzeyinde tümör hücre ve dokuların başarılı aşılama uygulaması.

Merhaba, ben Susan Paa. Almanya'daki Burg Esen Üniversitesi Fizyolojik Kimya Enstitüsü, Biyokimyasal Endokrinoloji Bölümü'ndenim. Merhaba, ben Daniel Ze Basian Dole.

Susan ile aynı kurumdan geliyorum. Merhaba, ben Mann, Burg Üniversitesi Anatomi Enstitüsü Nöro Bölümü'nden. Size CH X kültürü ve komembran denemesinin gerçekte nasıl çalıştığını göstereceğiz.

Öyleyse laboratuvara gidelim. Son deneysel çalışmaların çoğunda, Chico zarı olan kam, yumurta kabuğundan bir pencere kesilerek açığa çıkarıldı ve deneyler ovo'da gerçekleştirildi, bu da CAM'ın erişilebilirliğinde ve gözlem ve fotoğraf dokümantasyonu olasılıklarında önemli sınırlamalara neden oldu. Civciv embriyolarının X ovo kültürleri, kam ve civciv embriyosunun erişilebilirliğini önemli ölçüde kolaylaştırır.

Lütfen, etkilerin in vivo olarak kolayca belgelenmesini ve embriyonun deneysel manipülasyonunu sağlayan atan kalbe bakın. Video makalemizde, çok sayıda Bilimsel soru için X ovo kültürünün başarılı bir şekilde uygulanmasının adım adım bir gösterimini sunacağız. Yumurtalar kuluçkaya yatırılır Hareketli bir tepsiye sahip bir kuluçka makinesinde.

Burada, yumurtaları günde 12 kez sürekli olarak döndüren ısıtma elemanını ve tepsi hareket ettiriciyi görebilirsiniz. İnkübatörün altındaki plastik kaplara su ilave edilerek nem %60'ta tutulur ve inkübasyona başlamadan önce inkübasyon sıcaklığı 37,5 santigrat dereceye ayarlanır. Kir, tüyler ve dışkılar yumurta kabuklarından dikkatlice çıkarılır, yumurtalar etanol veya dezenfektan ile mekanik olarak silinir, ancak embriyoların hayatta kalma oranlarını önemli ölçüde azaltır.

Yumurtalar, kuluçka makinesinin hareketli tepsisine yatay olarak yerleştirilir. Serbest Rotasyonu sağlamak için lütfen tek tek yumurtalar arasında yeterli mesafe bıraktığınızdan emin olun. Kuluçka sonrası 72 saat boyunca yumurtalar kuluçka makinesinden çıkarılır ve embriyonun bulunduğu yumurtaların üst tarafı kurşun kalemle işaretlenir.

Embriyo belli bir dereceye kadar dönmeye direndiği ve burada kaldığı için Daha iyi bir his için, Yumurtaları kırmak için eldiven kullanılmamalı, eller% 70 etanol ile dezenfekte edilmelidir. Yumurta, üstünde bir kalem işareti ile yatay olarak tutulur ve üçgen bir manyetik karıştırma çubuğunun kenarında çatlatılır Çatlatma işlemleri sırasında maksimum kuvvet kontrolü için dirsekler tezgah üstüne dayanmamalıdır. Yumurta kabuğunun yanı sıra yumurta zarının da çatlama sırasında açılması önemlidir, yumurta akının sızması, yumurta zarının delindiğinin güvenli bir işaretidir.

Yumurta, vatansever yemeğinin dibine yakın tutulur. Bu ilk açma prosedürü sırasında yumurta akının daha fazla sızmasını önlemek için, vatansever tabağının altındaki yumurta akının hala yumurtanın içindeki geri kalanına bağlı olması önemlidir. Bu, çatlaktan geçen meridyene ve yumurtanın ekvatoruna başparmak ve orta parmaklarla hafifçe baskı uygulayarak yumurta sarısını yerinde tutan yumurtanın içinde bir vakumla sonuçlandığından, boşluğu ve yumurta içeriğinin ekstrüzyonunu düzenlemek mümkündür.

Yumurtanın içeriği daha sonra yumurta sarısı zarar görmeden Petri kabına aktarılabilir. Yumurta yavaşça kaldırılırsa ve kabuğun her iki yarısı da dikkatlice ayrılırsa, ex ovo kültürler daha sonra bir tepsiye yerleştirilir, bir inkübatöre geri gönderilir ve 37.5 ila 38.2 santigrat derece ve% 70 nemde tutulur. Karbondioksit veya oksijen kaynağı gerekli değildir.

Kapak ve tabak arasında ara parçaları olan özel vatansever tabaklar ve havalandırma ızgaralı inkübatörler kullanılıyorsa, havalandırma ızgarası yarıya kadar Açık tutulmalıdır. Otoklav filtre Kağıtları, kamın en az tahrişine neden oluyor gibi göründükleri için kam üzerine uygulanan sıvı maddeler için destekleyici malzeme olarak kullanılır. Uygulama bölgesi, embriyo ile kamın sınırı arasında yarı yolda olmalıdır, aksi takdirde embriyo, iletilen ışıktaki etkilerin mikroskobik gözlemini engeller.

Buradaki sıvı, kurumayı önlemek için filtre kam üzerine yerleştirildikten hemen sonra atropin uygulanmalıdır. Ya ek dozlar ya da tampon her gün tekrar uygulanmalıdır. Kam tamamen geliştiğinde, altı adede kadar farklı numune uygulanabilir ve etkileri bir Tek kam halkaları üzerinde karşılaştırılabilir: Bir mililitrelik pipet ucundan, ağırlığı en aza indirmek ve kamın girintisini önlemek için mümkün olduğunca ince kesilmelidir.

Halka daha sonra kam üzerine uygulanır ve hücreler halkanın içine pipetlenir. Bir Hamilton Mikrolitre şırınga% 70 etanol ile birkaç kez durulanır ve son olarak steril fosfat tamponlu salin veya PBS ile durulanır, Mikro şırınga dikkatlice hazırlanmış bir hücre süspansiyonu ile doldurulur, ancak şırınga iğnesi ile kam ve göz katmanlarına hızlı bir şekilde nüfuz eder ve hücre süspansiyonunu sürekli olarak enjekte eder. Enjekte edilen hücre süspansiyonunun kaybını önlemek için iğne gözde birkaç saniye kalmalıdır Sızıntı kontrolü X Ovo ile.

Üç gün boyunca kuluçkaya yatırılan yumurta kültürleri, uzuv tomurcuğu donörleri olarak kullanılır. Embriyo bağlı yumurta sarısı damarlarından diseke edilir. A daire kesilerek, embriyo küçük bir dren kaşığı kullanılarak soğuk steril PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarılır ve çalkalama ile yıkanır.

Embriyo daha sonra steril PBS ile doldurulmuş taze bir Petri kabına aktarılır ve çevredeki zarlardan serbest bırakılır ve ince bir forseps ile dikkatlice parçalanır. Uzuv tomurcukları, vücuda mümkün olduğunca yakın forseps ile ayrılır, kavranır ve sekiz ila 10 günlük bir ev sahibi tavuğun kamına aktarılır. İstenilen uygulama bölgesinde, kam forsepsin bir parçası ile hafifçe kazınarak seçici olarak travmatize edilir.

Daha sonra greft kavranır ve forsepsin diğer parçası ile kam üzerine katmanlanır. Kurban dişi Fare bir tahtaya sabitlenmiştir. Karın duvarı, orta hat boyunca kesilen %70 etanol ile nemlendirilir ve cilt flepleri pimlerle yanal olarak sabitlenir.

Rahim karından çıkarılır, ayrılır ve bir behere aktarılır. Soğuk PBS ile. Embriyonik zarlar, gösteri amaçlı forseps kullanılarak dikkatlice çıkarılır.

Uzuv tomurcuklarının daha iyi görülebilmesi için burada 16 günlük bir fare embriyosu gösterilmektedir. Optimal aşılama sonuçları sadece elde edilir. Bununla birlikte, 10 ila 13 günlük embriyolardan uzuv tomurcukları kullanılırsa, uzuv tomurcukları kesilir veya vücuda mümkün olduğunca yakın ince forseps kullanılır.

İstenilen uygulama bölgesinde, CAM forseps ile nazikçe kazınarak seçici olarak travmatize edilir. Daha sonra uzuv tomurcukları kavranır ve sekiz ila 10 günlük bir konakçı tavuğun CAM'sine aktarılır. Greft, fazla PBS'yi çıkarmak için son bir aşılamanın amaçlanmadığı kamın bir tarafına bir veya iki kez yerleştirilir.

Greftler ideal olarak bir kan damarı tümörünün Y çatallanmasının yakınında kam üzerine yerleştirilir. Biyopsiler steril neşterlerle bir ila iki milimetreküp parçaya bölünür. Biyopsi yüzeyinden materyal alınması, kas veya bağ dokusu ile kontaminasyon riskini artırır.

İstenilen uygulama bölgesinde, CAM hafif kazıma ile seçici olarak travmatize edilir. Biyopsi örneğinin çekirdeğinden bir parça, sekiz ila 10 günlük bir konakçı tavuğun CAM'sine aşılanır. Greftler ideal olarak bir kan damarının Y çatallanmasının yakınında kam üzerine yerleştirilir.

Greft daha sonra minimal PBS bağlı olarak CAM'a aktarılır. Grefti, kamın sonuçta ortaya çıkan bir girintisine manevra yapmak için hafif basınç uygulanabilir. Ev sahibi Civciv embriyosu dekapitasyon ile öldürülür.

Bağlı greftli CAM, dairesel bir kesi ile çıkarılır ve PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarılır. Greftten eski bağlantı yeri dışında fazla CAM kesilir. Yine istenilen uygulama yerinde.

Yeni bir konakçı civciv embriyosunun kamı, nazikçe kazıma ile seçici olarak travmatize edilir ve greft, minimal PBS Bağlı olarak ikinci konakçının kamına aktarılır. CH X'in veya kültürün gerçekten nasıl çalıştığını gösterdik. Size Orval deneylerine kıyasla avantajlarını gösterdim ve uygulaması için bazı örnekler verdim.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve Deneylerinizde iyi şanslar.