Tek birim In vivo Kayıtlar

Bugün, farenin optik kiazmasından in vivo kayıt yapmak için geliştirdiğimiz bir kayıt sistemini göstereceğiz. Bu tür kayıtlar sıçanlarda çok nadirdir, çünkü kısmen optik siniri oluşturan retinal ganglion hücre aksonları çok küçüktür, bu da tek tek hücrelerden kayıt yapmayı zorlaştırır ve sıçan retinal dejenerasyon için yaygın bir hayvan modeli olduğundan, bu tür kayıtlar çok sayıda yararlı bilgi üretme potansiyeline sahiptir. Bu kayıtları elde etmenin anahtarı, yüksek sinyal-gürültü oranına sahip ince çaplı aksonlardan aksiyon potansiyellerinin kaydedilmesine izin veren uzun keskin bir uca sahip tasarladığımız tung vitray elektrotlarındaydı.

Bu elektrotların üretim sürecinde size yol göstereceğiz ve size nasıl yapılacağını, hayvanı stereotaktik cihaz üzerine nasıl yerleştirdiğimizi göstereceğiz ve sonra size tek bir ganglion hücresinden spike trenlerinin kaydedilmesine bir örnek göstereceğiz. Elektrotları üretmek için üç ana ekipmana, mikro pipetleri yapmak için standart bir cam üfleyiciye ihtiyaç vardır. Tungsteni keskinleştirmek için bir dikiş makinesi ve 40 x objektifli standart bir mikroskop kullanılır.

Ek olarak, bağlı kutuplu bir grafit halkaya ihtiyaç vardır ve konsantre potasyum hidroksit ve sodyum nitrat çözeltisine yerleştirilecektir. Bu, dikiş kolunun altına yerleştirilir ve daha sonra ince bir tungsten tel parçası dikiş koluna bantlanır, kısmen çözeltiye daldırılır. Uçlar daha sonra bir uçtaki grafit direğe dikiş koluna uygulanır.

Diğer iki tarafta uçlara iki volt uygulanacak ve dikiş makinesi açılacaktır. Bu, dunston'u çözeltiye batırır ve iki dakika boyunca elektromanyetik olarak keskinleştirir. Tungsten keskinleştirildikten sonra, dikiş kolundan dikkatlice çıkarılır, daha sonra fazla çözeltiyi çıkarmak için suya batırılır ve daha sonra 40 x objektif altında mikroskop altına yerleştirilir.

Cam mikro pipet, yaklaşık bir ila iki mikron çapında küçük çaplı bir açıklığa sahiptir. Keskinleştirilmiş tungsten daha sonra mikro pipetin arka ucuna dikkatlice yerleştirilir ve mekanik bir mikro manipülatör ile itilir. Tungsten camın ucundan çok dikkatli bir şekilde itilir.

Tungsten ve cam arasında sıkı bir uyum olması önemlidir ve az miktarda camın gerçekten kırılması için yeterince itmek yaygındır. Tungu cama sabitlemek için mikro pipetin arka ucuna az miktarda çılgın yapıştırıcı uygulanabilir. Artık elektrot üretimi tamamlandığına göre, empedansı bir metal elektrot Empedans testi kullanılarak ölçülür.

Genellikle bir mega ohm'a yakın empedanslar ararız. Elektrot daha sonra çok kırılgan olduğu için güvenli bir şekilde saklanması için bir kutuya konur. Görsel Uyaranlar, hareketli bir platform üzerine yerleştirilmiş bir monitörde sunulur.

Isıtma battaniyesi, hayvanın vücut ısısını kontrol etmek için kullanılır ve stereotaktik sistem, burada gösterilen mikro sürücünün brüt hareketine izin verir. Hipodermik kılavuz iğne kalkanındaki metal kasa, gürültü seviyelerini azaltmak için hareket eden kayıt elektrodu. Kılavuz iğne beyne yerleştirilir ve elektrodu kılavuz iğneden yavaşça indirmek için bir mikro sürücü kullanılır.

Bu, metal kasanın hayvanın kafatasına dayanacak bir çapraz çubuğa indirildiği yerde gösterilmiştir. Kılavuz iğne, gösterildiği gibi çapraz çubuğun altından dışarı çıkacaktır ve metal kasa ile çapraz çubuk arasındaki elektrik teması, gürültü seviyelerini azaltmak için hareket eder. Hayvan daha sonra ısıtma battaniyesinin üzerine yerleştirilir.

Kulak çubukları dikkatlice yerleştirilmiştir. Bu noktada başın düz kaldığından emin olmak önemlidir. Daha sonra kafanın her yönde olduğundan emin olmak için bir diş çubuğu yerleştirilir.

Vazelin kullanılarak bir rektal prob yerleştirilir. Bu, daha sonra ısıtma battaniyesinin sıcaklığını kontrol etmek için kullanılan vücut ısısını ölçecektir. Vücut ısısı 36 ila 37 derece arasında kalmalıdır.

Genellikle dakikada yaklaşık 300 fit olan kalp atış hızını izlemek için cilde tek bir EKG kablosu yerleştirilir. Kalp atış hızı, anestezik derinliğin iyi bir göstergesidir. Hayvanın yaşamsal belirtileri, özel yazılımlarla sürekli olarak izlenir.

Bunlar, CO2 olarak adlandırılan kan basıncını, vücut ısısını ve kalp atış hızını içerir. Daha sonra kafatasının üst kısmından deri çıkarılır ve kafatası açığa çıkar. Optik kiazmayı bulmak için kullanılan uygun kafatası işaretlerini görmek için kafatasını iyice temizlemek önemlidir.

Çapraz çubuk tertibatı daha sonra yerine yerleştirilir. Bu, kafatası üzerinde daha sonra delinecek ve çıkarılacak olan beş milimetrelik bir dairenin izini sürmek için kullanılır. Delik, burada gösterilen bgma kafatası İşaretleyicisinin etrafına açılacaktır.

Açıkta kalan kafatası, kafatası delinmeden önce delinecek olan bgma'nın etrafında dairesel bir kalem işareti ile gösterilir. Stereotaksik sistem torema kalibre edilmelidir ve bu, kılavuz iğneyi tam olarak bgma üzerine hizalayarak ve stereonun konumunu belgeleyerek yapılır. Delme işleminden sonra kafatası çıkarıldı ve beyin açığa çıkarıldı.

Kafatası delindikten sonra, göz hareketlerini önlemek için hayvan felç edilir ve havalandırılır. Bu, intravenöz gamin enjeksiyonu ile yapılır. Solunum, olduğu gibi dikkatlice izlenir ve solunum durduğunda, ventilasyon tüpü trakeal konektöre yerleştirilir, bu noktada hayvan yapay olarak solunum edilir.

Kılavuz iğne daha sonra beyne indirilir. Kayıt elektrodu, gyal boyunca kafatasının yaklaşık sekiz ila 10 milimetre altına indirilecek ve burada optik kiazmadaki görsel hücrelerden gelen aksiyon potansiyelleri kaydedilebilir. Elektrot yavaş yavaş beyne yüklenir.

Mikro sürücü ile, görsel bir hücrenin kendiliğinden yükseldiği duyulabilir, hücreyi dinleyebilir, alıcı alanında elde tutulan bir değneğin varlığına yanıt verebilir. Sürüklenen derecelendirme daha sonra sunulur ve bu noktada, optik kiazma kullanarak retinal ganglion hücrelerinin yanıt özelliklerini incelemek için ilgilenilen herhangi bir görsel uyaran kullanılabilir. Kayıt.