Canlı bir Host Transgenik Leishmania Parazitlerinin in vivo Imaging

Bu prosedürün genel amacı, canlı bir konakta leishmania parazit enfeksiyonlarını görüntülemektir. Bu, önce transgenik biyolüminesan parazitlerin üretilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, fareleri leishmania parazitleri ile enfekte etmektir.

Prosedürün üçüncü adımı, enfekte farelerin IVIS ile biyolüminesan görüntülenmesidir. Prosedürün son adımı, biyolüminesan verilerin analiz edilmesidir. Sonuç olarak, IVIS kullanımı yoluyla canlı farelerde transgenik leishmania parazitleri tarafından üretilen biyolüminesansın kantitatif ölçümleri olan sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem, uzunlamasına çalışmalar sırasında nispi parazit yükünün çeşitli anatomik konumlarda ve aynı hayvanda analiz edilmesine izin verir. Merhaba, ben Colin Fer, Iowa Üniversitesi'nde immünoloji yüksek lisans programında öğrenciyim. Dr.Mary Wilson'ın laboratuvarında çalışıyorum.

Merhaba, ben Mary Wilson. Iowa Üniversitesi'nde İç Hastalıkları, Mikrobiyoloji ve Epidemiyoloji Bölümlerindeyiz. Ayrıca Iowa City VA Tıp Merkezi'nde de çalışıyoruz.

Merhaba, ben Lori, Holman'ı seviyorum. Ben de Wilson Laboratuvarı'ndayım. Bugün size bir in vivo görüntüleme sistemi kullanarak canlı bir hayvan konakçısında biyolüminesan leishmania parazitlerini görüntülemek için bir prosedür göstereceğiz.

Bu prosedürü laboratuvarımızda farelerde bulaşıcı hastalık modeli leishmaniasis'i incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Parazitler in vitro olarak büyütülür ve virülansı korumak için hayvanlardan geçer.

Parazit türü dozu ve enfeksiyon kökü araştırıcı tarafından belirlenir. İki enfeksiyon yolu göstereceğiz, kulak iğnesinde bir intradermal enfeksiyon ve kuyruk yoluyla intravenöz bir enfeksiyon. İntradermal enfeksiyon için, fare önce intraperitoneal sıvı anestezi enjeksiyonu ile sakinleştirilmelidir.

Hayvanı, karnı yukarıda ve başı aşağı bakacak şekilde sırt derisinden sıkıca tutarak elle tutun. Enjeksiyon bölgesini %70 Ethel veya izopropil alkol ile temizleyin. İğneyi eğim yukarı ve hafif açılı olacak şekilde konumlandırın.

İğnenin ucu, enjeksiyon sırasında karın duvarının alt bölgesine hafifçe nüfuz etmelidir. Hayvan sakinleştirildikten sonra, enfeksiyon bölgesini alkolle temizleyin. 10 mikrolitre parazit içeren bir şırınga yükleyin.

İşaret parmağının üzerine koruyucu bir kapak yerleştirin. Bu durumda, ortak bir 50 mililitrelik konik boru kullanılır. Ardından fareyi sırt üstü yatırın ve kulağı başparmak ile koruyucu kapak arasında tutun.

İğneyi kulak iğnesinin dermisine sığ bir açıyla sokun ve şırınga pistonuna yavaşça bastırın. Cilt hafifçe kabarmış gibi görünebilir. Kulağın alt tarafında herhangi bir sıvı bulunmamalıdır çünkü bu, iğnenin kulak iğnesinden geçtiğini gösterir.

İntravenöz kuyruk aşılaması yapmak için önce 200 mikrolitre parazit içeren bir şırınga yükleyin. Ardından, fareyi birkaç dakika bir ısı lambasının altına yerleştirin ve ardından bir kısıtlama cihazına aktarın. İşaret parmağının üzerine koruyucu bir kapak yerleştirin.

Hayvanın kuyruğunu başparmak ve koruyucu kapak arasında tutun ve nispeten gergin tutun. Enjeksiyon bölgesini alkolle temizleyin. Daha sonra iğneyi, kuyruğun koruyucu parmak örtüsü üzerinde nispeten aynı açıyla yuvarlandığı iki yanal kuyruk damarından birine sokun.

Kuyruk şırınga pistonuna yavaşça basarken, damar berrak bir şekilde açılmış gibi görünecektir. İğne eğimi damarın dışında olmadığı sürece pistonun bastırılmasında veya cildin kabarmasında herhangi bir zorluk olmamalıdır. Lucifer'i enjeksiyona hazırlamak için, Lucifer'i KO'nun PBS'sinde magnezyum ve kalsiyum ile veya magnezyum olmadan mililitre şırınga başına 15 miligram konsantrasyona kadar sulandırın, Lucifer'i 0.2 mikrometrelik bir filtreyle filtreleyin.

D Lucifer'in alikotları, enjeksiyondan önce kullanım Lucifer'i bir su banyosunda 37 santigrat dereceye kadar ısıtana kadar eksi 80 derecede saklanabilir. Hayvanın üzerindeki enjeksiyon bölgesini alkolle temizleyin. Fare intraperitonealini mililitre başına 15 miligram enjekte edin.

Lucifer enjeksiyonundan yaklaşık 10 ila 15 dakika sonra kilogram başına 150 miligramlık bir dozda DPBS'de Lucifer çözeltisi. Hayvanlar IVIS ile görüntülenebilir, önce hayvanları bir tutma odasına yerleştirerek ve onları flore maruz bırakarak uyuşturun. Anestezi uygulanmış hayvanları görüntüleme odasına aktarın ve bunları, manifolda bağlı burun konileri sürekli ve düzenli bir flor akışı sağlayacak şekilde konumlandırın.

Canlı görüntü yazılım programını açın ve IVIS'i başlatın Deneylerimiz için. IVIS 200 sistemini kullanıyoruz. CCD kamera, başlatıldıktan sonra otomatik olarak çağrılacak ve uygun sıcaklıkta tutulacaktır.

IVIS. Kamera ayarları ve görüntü alma parametreleri, IVIS sistem kontrol penceresinde ayarlanır. Önemli parametreler arasında görüntüleme modu, pozlama, zaman döndürme odağı ve konu yüksekliği, F durağı ve görüş alanı bulunur.

Tek bir görüntü için veri toplamayı başlatmak için IVIS sistem kontrol penceresinde al düğmesine basın veya birden fazla görüntü için sürekli fotoğraf al düğmesine basın. Deneylerimiz için 62. varsayılan pozlama ayarını kullanıyoruz. Yakın çekim bir görüntü daha yüksek çözünürlük sağlayabilir, ancak daha geniş bir görüş alanı kullanılarak çekilen bir görüntüye kıyasla daha fazla hassasiyet sağlamak zorunda değildir.

Görüntüleme işleminden sonra hayvanları görüntüleme odasından çıkarın ve kafeslerine geri koyun. Anesteziden kurtulana kadar hayvanları izleyin. Lüminesans verileri, canlı görüntü yazılımı kullanılarak analiz edilir ve CCD kamera tarafından algılanan foton sayısı olarak ifade edilen ışık yoğunluğuna karşılık gelir.

Bu veriler, hayvanların siyah beyaz bir fotoğrafının üzerine yerleştirilmiş sahte renkli bir görüntü ile temsil edilir. Görüntünün belirli alanları, ilgi alanları oluşturularak analiz edilebilir. Verileri analiz etmenin en basit yollarından biri, bir ilgi alanı seçmek ve algılanan saniyedeki ortalama foton sayısını ölçmektir.

Bu veriler daha sonra kolayca bir formaya aktarılabilir ve daha sonra grafikler oluşturmak için kullanılabilir. İnsan viseral leishmaniasis leishmanias'a neden olan paraziti eksprese eden lusiferaz ile beş haftalık bir enfeksiyon örneği. Fantom chaga ssu eğik çizgide ir bir SAT tire LUC burada gösterilmiştir.

Beş haftalık enfeksiyondan sonra, tüm farelerin karaciğerlerinde ve kemiklerinde ve bir ve ikinci farelerin dalaklarında viseral parazitler tespit edilebilir. Biyolüminesans parazitlerden yayılan fotonların tespitini en üst düzeye çıkarmak için ön kinetik çalışmalar gereklidir. Az önce gösterilen deneyde, Lucifer enjeksiyonundan sonra her iki dakikada bir enfekte farelerden bir dizi görüntü toplandı, yayılan ışığın büyüklüğü ölçüldü ve aşılandı.

Maksimum tespit noktasını belirlemek için, parazit aşılamasının etkinliğini değerlendirmek için IVIS görüntüleme teknolojisi kullanılabilir. Burada, ampul deniz farelerinin visseral bir leishmania türü ile aşılandığı bir örnek gösterilmektedir. Enfeksiyondan bir saat sonra.

Fareler IVIS ile analiz edildi. Bu ilk görüntü, lüminesans sinyali ölçülmeden hemen önce çekilmiş farelerin siyah beyaz bir fotoğrafıdır. Kırmızı oklar, her hayvandaki enjeksiyon bölgesini gösterir.

Bu sonraki görüntüde, lüminesansın sahte renkli görüntüsü fotoğrafın üzerine yerleştirildi. Kırmızı dairelerle gösterilen ilgi alanları seçildi ve her bir ilgi bölgesinde lüminesans ölçüldü. Bu grafiği oluşturmak için veriler, enfekte olmuş ilgilenilen bölgenin ortalama lüminesansını eksi sahte enfekte olmuş kişinin ilgilendiği bölgeyi temsil eder.

IVIS, ly manasis'in fare modellerinde enfeksiyonun seyrini izlemek için de kullanılabilir. Bu örnekte, ampul, deniz fareleri sıfırıncı günde 10 üzeri beş kuvvetinde deri altından aşılanmıştır. Leishmania Mexicana, lusiferazı eksprese eder ve enfeksiyondan sonraki haftalarda görüntülenir.

Enfeksiyondan 10 ila 31 hafta sonraki temsili görüntüler burada gösterilmektedir. Aynı veriler nicel biçimde de gösterilir. Bu dağılım grafiği, enfeksiyon sonrası çeşitli zaman noktalarında net ilgi alanlarını temsil eder.

Az önce size bir in vivo görüntüleme sistemi kullanarak canlı bir hayvan konakçısında T transgenik İngiliz mani parazitlerini nasıl görüntüleyeceğinizi gösterdik. Unutmayın, bu prosedürü yaparken, siz ve hayvanlarınız için potansiyel sağlık risklerini en aza indirmek için uygun koruyucu giysi giymek ve güvenlik ekipmanı kullanmak önemlidir. İşte bu kadar.

Deneylerinizde iyi şanslar. Ve Iowa Üniversitesi'nin merkezi mikroskopi çekirdek tesisine ve Iowa City VA Hayvan Bakım tesisine özel bir teşekkür.