Memeli Hücrelerde DNA çift iplikli Break (DSB) Tamir Analizi

Bu makale, GFP tabanlı floresan açıklar

Bu video protokolünde, bir memeli hücre hattında NHEJ veya HR ile DNA çift sarmallı fren onarımının verimliliğini ve doğruluğunu ölçmek için bir yöntem gösterilmiştir. Prosedür, NHEJ veya HR muhabir kasetinin kromozomal olarak entegre edilmiş tek bir kopyasını içeren bir hücre hattı oluşturmakla başlar. Bu raportör hücreler daha sonra bir plazmit ve DS kırmızısı eksprese eden I SCE ve bir plazmit karışımı ile transfekte edilir.

Ben sce. Bir endonükleaz, raportör yapısında çift iplikçikli bir kopma üretir ve DS RED bir transfeksiyon kontrolü görevi görür. GFP pozitif ve DS kırmızı pozitif hücrelerin yüzdesi daha sonra istenirse NHEJ veya HR'nin verimliliğini ölçmek için faksla analiz edilir.

Onarımın aslına uygunluğu, raportör ürünlerin e coli'de kurtarılması ve onarım ürünlerinin sıralanmasıyla analiz edilir. Bu şekilde, belirli bir hücre hattındaki ikili iplik kopmasının veya DSB onarımının verimliliği ve aslına uygunluğu, onarım olaylarının akış sitometrik nicelleşmesine ve onarım ürünlerinin sıralamasına dayalı olarak belirlenir. Bu yöntemin, çift telli fren onarımının analizi için mevcut yöntemlere göre birçok avantajı vardır.

Her şeyden önce, bu yöntem özellikle homolog bir rekombinasyon ile homolog olmayan ve birleştirme arasında ayrım yapar. Daha sonra yöntem oldukça kantitatiftir, milyonlarca hücrenin akış sitometrisi ile analizine izin verir ve daha sonra yöntem, antibiyotiğe dirençli cls seçimi için onarım tamamlandıktan sonra hücrelerin kapsamlı bir şekilde paketlenmesini gerektirmez. Ve son olarak, onarımın tamamlanması, yeşil hücrelerin görünümüne bakılarak gerçek zamanlı olarak izlenebilir.

Ve bu yöntem, virüs mutant hücre tiplerinde HR ve HEGA onarım etkinliğinin ölçülmesi veya ilaç tedavilerinin ardından gibi bir onarım alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Hücre döngüsünün farklı aşamalarında A onarımını inceleyin ve onarım oranını ölçün Çok genel. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir çünkü iyi bir transfeksiyon verimliliği elde etmek önemlidir.

Bu prosedürde. Çift sarmallı DNA kırıklarının onarımı için tahlil yapmak için iki raportör kaset kullanılır. Bir kaset, homolog olmayan uç birleştirmeyi veya N-H-E-J-D-N-A onarımını incelemek için kullanılır.

Diğeri ise homolog rekombinasyona veya HR DNA onarımına, homolog olmayan uca bakmak için kullanılır. Raportör kasetine katılmak, PEM bir geninden veya GFP PEM bir geninden tasarlanmış üç kilobaz intronlu bir GFP geni içerir. Kısacası, P one introsu, çift sarmallı kırılmaların indüksiyonu için Hintçe üç ve I SCE bir endonükleaz için tanıma dizileri ile çevrili bir adenoviral ekzon içerir.

I SCE bir site ters çevrilmiş bir oryantasyondur, I SCE bir palindromik olmayan bir tanıma dizisine sahiptir, bu nedenle iki ters çevrilmiş site uyumsuz oluşturur. DNA uyumsuz biter. DNA uçları, doğal olarak oluşan dss'yi en iyi şekilde taklit eder.

Düzenlenmemiş bir NAEJ kaseti, adenoviral ekzon G-F-P-O-R-F'yi bozduğu için GFP negatiftir. Çift sarmallı DNA kırılmalarının ISEE bir tarafından indüksiyonu üzerine, adenoviral ekzon çıkarılır ve NHEJ, GFP geninin işlevini geri yükler. Homolog rekombinasyon raportör kaseti ayrıca HR kasetindeki GFP PEM one yapısına dayanmaktadır.

G FP PEM one'ın ilk ekzonu, üç kısıtlama bölgesinin eklenmesi ile birlikte 22 baz çifti delesyonunu içerir. Ben SCE bir Hintçe üç I SCE E bir. Silme işlemi, GFP'nin burada da bir NHEJ olayı tarafından yeniden oluşturulamamasını sağlar.

I SCE one siteleri ters yönelimdedir. Yani I SCE bir sindirim uyumsuz uçlar bırakır. GFP PMM'nin ilk kopyasını, GFP M1'in daha az TG, daha az ilk ekzon ve introsu takip eder. Sağlam yapı, I sce E bir sindirim ile bir çift iplikçik kırılmasının indüksiyonu üzerine GFP negatiftir.

Fonksiyonel GFP geni, ilk GFP PMM'nin iki mutasyona uğramış kopyası arasındaki bir gen dönüşüm olayı ile yeniden oluşturulur: bir ekson, diğer DSB onarım türleri, örneğin tek sarmallı diz çökme gibi. Ve NHEJ, GFP genini yeniden oluşturmayacaktır. GFP geninin ikinci kopyası eksik olduğundan.

İlk A TG kodonu ve ikinci ekzon çözünürlüğü, çaprazlama veya tek sarmallı diz çökme yoluyla GFP aktivitesini geri yüklemez. Bu nedenle bu tasarım, memeli hücrelerinde baskın HR yolu olan gen dönüşümü ile çözünürlüğün özel olarak tespit edilmesine izin verir. Bu prosedüre başlamak için, yüksek kaliteli bir NHEJ veya HR raportör plazmid stoğu hazırlamak, plazmidin 10 mikrogramını doğrusallaştırmak ve DNA'yı sindirim çözeltisinden saflaştırmak için Kyogen'in endo free kitini kullanın.

Plazmid hazırlığının ayrıntıları için ekteki yazılı protokole bakın. Transfeksiyon için hazırlık olarak. Normal insan fibroblastlarının en iyi yetiştirme koşulları altında korunduğundan emin olun.

Donmuş bir şişeden başlıyorsanız, transfeksiyondan önce hücreleri iki kez bölün. Bir birleşme hücresi plakasından başlayarak, hücreler bir kez bölünürse, hücreler %70 ila 80 oranında birleşir. Bu, 100 milimetrelik bir plakada kaplanmış beş kez 10 ila beşinci hücre için yaklaşık iki gün sürer.

En iyi transfeksiyon verimliliği için, hücreleri logaritmik büyümeye getirin. Aktif olarak büyüyen kültür, iki adet 100 milimetrelik plakadan altı hücrenin yaklaşık iki kez 10'unu hasat etmek için yüzeye tutturulmuş yuvarlak hücreler olarak görülen M evresindeki hücreleri içerir. Hücrelerin aşırı tripsin yapmaması çok önemlidir, hücrelerin% 80'i plakadan ayrılır ayrılmaz tripsini durdurur.

Hücreleri NHDF çözeltisinde yeniden askıya alın. Hücreler NHDF çözeltisine duyarlı olduğundan, inkübasyon süresini en aza indirin ve hücreleri nazikçe karıştırın. Daha sonra, normal insan fibroblastları için hücreleri 0.5 mikrogram doğrusallaştırılmış raportör yapısı ile transfekte etmek için amaxa nükleo efektörünü kullanın.

Bu transfeksiyon koşulları, transfeksiyondan 24 saat sonra integrasyonun çoğunluğu için bir raportör yapısının tek bir kopyasının, genetik mililitre başına bir miligram veya G dört 18 ile entegrasyonu ile sonuçlanır. Kromozomal olarak entegre raportör yapılarına sahip hücreleri seçmek için, yedi ila 10 gün boyunca seçime devam edin, ardından tek tek G 4 1 8 dirençli kolonileri seçin veya dirençli klonları bir araya getirin. Kültürü yaklaşık beş adet 100 milimetrelik plakaya genişletin.

İleride kullanmak üzere üç plakayı dondurun ve kalan iki plakayı 100 milimetrelik plaka başına beş kez 10 ila beşinci hücreye genişletin. Beş transfect için genellikle on yüz milimetre plaka yeterlidir. Kaplamadan iki gün sonra, raportör yapıyı içeren hücreler %70 ila 80'e ulaştığında, biri plazmidi ifade eden beş mikrogram I sce ve 0.1 mikrogram DS kırmızı plazmid karışımı ile birleşir.

Bir transfeksiyon verimliliği kontrolü olarak, logaritmik olarak büyüyen bir kültürden altı hücrenin yaklaşık iki kez 10'unu transfekte etmek için makson nükleo efektörünü kullanın. DSP verimliliği, GFP pozitifin DS kırmızı pozitif hücrelere oranı olarak ölçüldüğünden, ISCE bir ve DS kırmızı plazmid karışımındaki değişiklikler sonuçları etkileyebilir. Plazmit kalitesi, transfeksiyon verimliliğini değiştirerek sonuçları da etkileyebilir.

Bu nedenle, tutarlı ölçümler elde etmek için, aynı plazmit karışımını tek bir deneyde kullanmak önemlidir Aynı zamanda, her kontrol için gerçekler için üç kalibrasyon kontrolü hazırlayın. Altı hücrenin 10'unun yaklaşık iki katını transfekte edin. Üç kontrol, plazmid eksprese eden beş mikrogram EGFP, beş mikrogram DS, kırmızı plazmit ve beş mikrogramdır.

Bir floresan proteini eksprese etmeyen bir kontrol plazmiti. Transfeksiyondan üç gün sonra, GFP ve DS'nin tespiti için filtreli floresan ters mikroskop ile GFP ve DS kırmızı proteinlerinin transfeksiyon etkinliğini ve ekspresyonunu doğrulayın. Kırmızı, faks analizinden önce hücreleri bir gün daha büyütür, transfeksiyondan dört gün sonra I SCE bir transfekte edilmiş hücre ve kontrol hücreleri hasat edilir. Bu aşamada, tüm hücrelerin toplanması ve yuvarlak şekilli hücrelere sahip olması çok önemlidir.

Bunu başarmak için, daha uzun tripsin izasyon süresi veya daha yüksek bir tripsin konsantrasyonu kullanın. Hücrelerin %99'unun plakadan ayrıldığını ve yuvarlak bir şekle sahip olduğunu doğrulamak için hücreleri mikroskop altında inceleyin. Hücreleri 500 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın ve faks tüplerine aktarın.

Hücreleri buz üzerinde tutun ve birkaç saat buz üzerinde saklamak mümkünken onları ışıktan koruyun. En iyi sonuçlar için, hasattan hemen sonra hücreleri analiz edin. Ardından, gerçekleri TFP DS RED ve negatif kontrollerle kalibre edin.

Tüm floresan hücreleri analize dahil etmek için voltajı ve renk telafisini ayarlayın. Deney numunelerinin floresan yoğunluğunun kontrollerinkinden daha düşük olduğunu unutmayın. Gerçekleri kontrollerle kalibre ettikten sonra, GFP ve ds arasındaki potansiyel etkileşimi önlemek için I SCE'yi analiz edin, bir transfekte hücre sayımı, her tedavi için en az 20.000 hücre sayın.

Kırmızı floresan, GFP pozitif veya DS kırmızı pozitif hücrelerin yüzdesini %25'in altında tutarYüzde daha yüksekse, DS RED veya I sce E bir plazmit miktarını azaltın. GFP pozitif hücrelerin yüzdesi D-N-A-D-S-P onarımının etkinliğine karşılık gelir ve DS kırmızı pozitif hücrelerin yüzdesi transfeksiyonun etkinliğini gösterir. D-N-A-D-S-P onarımının nispi verimliliğini, GFP pozitif hücrelerin DS kırmızı pozitif hücrelere oranı olarak hesaplayın.

Onarılan ihtiyati tedbirlerin doğruluğunu belirlemek için, genomik DNA'yı eco R bir enzim ile sindirerek ve yetkin e coli hücrelerine dönüştürerek raportör yapılarını kurtarın. Bu kurtarma, orijinal yapılar kısıtlama, sindirim ve sıralama ile analiz edilen bakteriyel bir replikasyon kökeni içerdiğinden mümkündür. Bunlar tipik gerçekler, kontrol kesitlerinin ve NHEJ ve HR deneylerinin sonuçlarıdır.

Floresan yoğunluğu ve floresan hücre sayısı, I SCE tek transfekte hücrelerde kontrollere göre daha düşüktür. Floresan sinyalindeki fark, bu hücrelerdeki GFP ve DS RED yapılarının kopya sayısındaki farktan kaynaklanmaktadır. Deneydeki her hücre, tümleşik raportör yapısının bir kopyasını içerir.

Böylece, başarılı onarım olayları, hücrelerin bir kısmında GFP genini yeniden oluşturur. NHEJ ve HR'nin etkinliği, GFP pozitifin DS kırmızı pozitif hücrelere oranı olarak hesaplanır. NHEA, insan hücrelerinde HR'den daha verimli bir süreçtir, insan fibroblastlarında, NHEJ verimliliği tipik olarak 0.6 ila 1.3'tür ve HR verimliliği 0.05 ila 0.3'tür.

Bu teknik, DNA onarımı alanındaki araştırmacıların HEG ve HR'deki çeşitli faktörlerin rollerini keşfetmelerinin ve memeli hücrelerinde NHEG ve HR'nin kinetiğini ve düzenlemelerini incelemelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, bir floresan tahlili kullanarak memeli hücrelerinde HR ve GJ'nin verimliliğini ve doğruluğunu nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.