Asılı Damla Yöntemi: 3D Melanom Sferoidleri Oluşturmak İçin Bir Teknik

- Sferoidler, in vivo tümör mimarisini taklit eden ve tümör içi etkileşimleri incelemeye yardımcı olan üç boyutlu in vitro hücre kültürü modelleridir. Kültürü kurmak için önce uygun ortamlarında tek hücreli bir melanom hücresi süspansiyonu hazırlayın. Daha sonra, bu hücre süspansiyonunun küçük hacimlerini, steril, yapışkan olmayan bir kültür kabının kapağının iç yüzeyine yeterince ayrı olarak yerleştirin. Kapağı dikkatlice ters çevirin ve bir hidrasyon odası oluşturmak için PBS içeren kültür kabının tabanına yerleştirin. Plakayı uygun koşullar altında inkübe edin.

PBS'den gelen nem, ortamın asılı damlalardan buharlaşmasını önler. Birkaç mikrolitre ortamı değiştirerek damlaları yenileyin. Yüzey gerilimi nedeniyle, damlacıklar küresel şekillerini korur ve plakanın iç yüzeyinden asılı kalır. Yerçekimi kuvvetleri, hücrelerin yayılmadan süspansiyon halinde kalmasını kolaylaştırır, ancak damlacıklar içinde üç boyutlu sferoidler oluşturmak için toplanır. Son olarak, sferoidleri hasat etmek için damlacıkları PBS ile durulayın. Bunları yapışkan olmayan bir kültür kabında toplayın.

Aşağıdaki protokolde, asılı damla yöntemi ile 451-LU melanom hücrelerinin üç boyutlu sferoidlerinin oluşturulmasını göstereceğiz.

- Başlamak için, genel hücre kültürü protokollerine göre% 10 FCS içeren RPMI ortamı kullanarak kültür melanom hücreleri 451-LU. Melanom sferoidleri oluşturmak için, kültürlenmiş melanom hücrelerini PBS'de yıkayın. Ardından, PBS'ye 5 mililitre 1x Tripsin-EDTA ekleyin. Oda sıcaklığında 3 ila 5 dakika inkübe edin. Tripsin nötralize etmek için %10 FCS içeren 5 mililitre RPMI ekleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri hasat etmek için 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Hücre peletini %10 FCS içeren RPMI'de yeniden süspanse edin.

Daha sonra, hücreleri sayın ve hücre süspansiyonunu mililitre başına 10.000 hücrelik bir nihai konsantrasyona seyreltin. Steril, yapışkan olmayan 10 santimetrelik bir hücre kültürü kabının kapağının iç yüzeyinde 40 x 25 mikrolitre hücre süspansiyonu lekeleri yapmak için elektronik bir çoklu pipet kullanın.

Ardından, kapağı hızlı ve yumuşak bir hareketle ters çevirin ve 5 mililitre PBS içeren hücre kültürü kabına yerleştirin. Asılı damla tabaklarını 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içinde 10 ila 14 gün boyunca kültürleyin.

İlk damla lekelenmesinden beş gün sonra, her damlaya %10 FCS içeren 10 mikrolitre RPMI eklemek için elektronik bir dağıtıcı kullanın. 10 ila 15 gün sonra, sferoidleri PBS ile kapaktan nazikçe durulayarak hasat edin. Sferoidleri taze, yapışkan olmayan bir hücre kültürü kabında toplayın.