TALEN Aracılı Hedefli Gen Entegrasyonu: Floresan Protein Geninin hiPSC'lere Hassas Bir Şekilde Yerleştirilmesi için Tasarlanmış Diziye Özgü Nükleazların Kullanılması

Ortamda insan kaynaklı pluripotent kök hücre veya hiPSC süspansiyonu ile başlayın. Bir çift transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleaz veya TALEN kodlayan plazmit ekleyin. Bir floresan protein geni taşıyan, bir antibiyotik direnç genine bağlanmış, hedef lokuslara spesifik hizalama için bitişik homoloji kolları olan bir donör plazmidi ile takviye edin.

Hücre zarlarında geçici gözenekler oluşturmak için karışımı elektropoze edin ve plazmit içselleştirmesini sağlayın. Hücrelerin içine girdikten sonra, TALEN kodlayan plazmitler işlenir ve TALEN'ler üretir - spesifik olmayan bir FokI kısıtlama endonükleaz bölünme alanına kaynaşmış bölgeye özgü bir TALE DNA bağlama alanından oluşan kimerik proteinler.

Her bir TALEN monomeri, tandem amino asit tekrar modüllerini içeren DNA bağlama alanı aracılığıyla, bir ara parça dizisi ile ayrılmış, zıt yönlerde her DNA zinciri üzerinde, nükleotid başına bir modül olan hedef lokusları tanır ve bunlara bağlanır. FokI alanları daha sonra ara parça dizisi içinde DNA'yı dimerize eder ve parçalar, çıkıntılarla çift iplikli kırılmalar oluşturur.

Bölünmüş bölgeyi çevreleyen bölgelere tamamlayıcı homoloji kolları içeren donör plazmidin varlığında, çift iplikli kırılmaları köprülemek için DNA onarım sentezi için şablon olarak homolog diziyi kullanarak homolojiye yönelik onarım gerçekleşir. Çentiklerin bağlanmasını takiben, araya giren floresan proteini ve antibiyotiğe dirençli genler konakçı genomuna entegre olur.

Büyümeyi desteklemek için besleyici bir hücre tabakası üzerine ekilen hiPSC'leri antibiyotik içeren ortamlarla tedavi edin. Promotörsüz antibiyotik direnç geni - yukarı akış endojen promotör tarafından yönlendirilir - TALEN ile düzenlenmiş hücrelerin seçimini kolaylaştırır.