Morfolino Aracılı Gen Düzenleme: Tek Hücreli Mağara Balığı Yumurtalarında Translasyonel Bloke Edici Morpholino Oligonükleotidleri Kullanan Bir Gen Yıkma Tekniği

Morfolinolar, doğal nükleotidlere kıyasla fosfat omurgası ve şeker yapılarında farklılıklar olan kısa, tek sarmallı, yeniden tasarlanmış oligonükleotidlerdir. Bu özellikler morfolinoların fizyolojik pH'daki stabilitesini arttırır. Bu varyasyonlara rağmen, morfolinolar, yıkılması istenen bir hedef genden spesifik mRNA dizisine tamamlayıcı oligonükleotidin tasarlanmasına yardımcı olan standart nükleobazları içerir.

Morfolino güdümlü gen düzenlemesi yapmak için, bir agaroz enjeksiyon plakasının kuyucuklarına yerleştirilmiş tek hücreli mağara balığı yumurtalarını alarak başlayın. Yumurtanın içinde bulunan sıvı dolu bir yapı olan yumurta sarısı kesesini bulmak için yarı saydam ve yuvarlak yumurtaları görselleştirin.

Tasarlanmış morfolinos içeren bir çözelti ile önceden doldurulmuş bir mikroenjeksiyon iğnesi alın. Solüsyonu doğrudan yumurta sarısına enjekte edin ve morfolinoların hücre sitoplazmasına girmesini sağlayın. Hücrelerin içinde hedef gen, sitoplazmaya taşınan mRNA'yı oluşturur.

Sitoplazma içinde, enjekte edilen morfolino, endojen başlatma bölgesinde tamamlayıcı hedef mRNA transkripti ile hibritleşir ve onun ötesine uzanır. Bu işlem, ribozomun daha büyük alt biriminin, bazı spesifik proteinlerle komplekslenmiş küçük ribozomal alt birimden oluşan yeni oluşan translasyon başlatma kompleksi ile bağlanmasını bloke eder.

Daha sonra, translasyon başlatma kompleksinin ilerlemesi sterik olarak engellenir, bu da mRNA'nın proteine translasyonunu durdurur. Son olarak, hedef protein konsantrasyonu, morfolinolar tarafından translasyonel blokaj nedeniyle azalır.