İnsan iPSC'lerinde PiggyBac Transpozon Aracılı Gen Düzenleme: PiggyBac Transpozon Sistemi Kullanılarak İnsan iPSC'lerine İlgilenilen Geni Entegre Etme Prosedürü

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin, hiPSC'lerin uygun elektroporasyon tamponunda askıya alınmasıyla başlayın. PiggyBac transpozaz kodlayan plazmitler ve donör plazmitlerinden oluşan bir çözelti ekleyin. Karışımı elektrostatik hale getirin.

Elektrik darbeleri, hücre zarlarına geçici olarak nüfuz ederek plazmitlerin hücresel alımını kolaylaştırır. Donör plazmitleri, hedef protein ve antibiyotik direnç genlerini braketleyen TTAA tekrarları ile çevrili, birbirinin ters çevrilmiş tamamlayıcıları olan transpozona özgü ters terminal tekrarları, ITR'leri içerir.

İfade edilen PiggyBac transpozaz proteinleri, ITR'lerin 3' uçlarında, TTAA tekrarlarının içinde çentikler oluşturur. Maruz kalan 3'-hidroksil grupları, yan DNA içindeki tamamlayıcı ipliğin nükleotidine saldırır, transpozon uçlarında TTAA saç tokaları oluşturur, böylece plazmidden transpozon yapısını serbest bırakır.

Transpozazlar, transpozon yapısının 5' uçlarında TTAA çıkıntıları oluşturmak için saç tokalarını çözer. Transpozazlar ayrıca konak genomundaki TTAA dizisinde çift iplikli kırılmalar oluşturur. Serbest bırakılan 3'-hidroksil transpozon uçları, kademeli uçlarda TTAA dizisine saldırır, bu da transpozon yapısının konakçı genomuna kovalent olarak katılmasına neden olur ve transpozon yapısını çevreleyen tek iplikli boşluklar bırakır. Konak DNA'sındaki bu boşluklar bağlanır ve transpozon yapısının kararlı bir şekilde bütünleşmesine yol açar.

Hücre dışı matriks proteini kaplı bir plaka üzerine ekilen hiPSC'leri antibiyotik içeren ortamla tedavi edin. Yukarı akış promotörü tarafından yönlendirilen antibiyotik direnç geni, gen düzenlenmiş hücrelerin seçilmesini sağlar.