CRISPR Birleştirici Aracılı Çoklu Gen Nakavt: Fare Bağırsak Hücrelerinde Homolog Olmayan Uç Birleştirme Yolu ile Birden Fazla Geni Aynı Anda Nakavt Etme Tekniği

CRISPR-concatemer-Cas9 sistemini kullanarak birden fazla geni aynı anda devre dışı bırakmak için, fare bağırsak hücresi süspansiyonunu içeren bir tüp ile başlayın. Tüpü, birbirine bitişik olarak entegre edilmiş çoklu kılavuz RNA'lar veya gRNA'lar için ifade kasetini içeren CRISPR-birleştirici vektörlerle destekleyin.

Her gRNA kaseti, amaçlanan geni ayrı ayrı devre dışı bırakmak için özel olarak tasarlanmıştır. Aynı tüpe Cas9 endonükleazını kodlayan ifade vektörleri ekleyin. Hücre-plazmit karışımını elektropore edin - plazmitlerin hücreye girişini kolaylaştırmak için elektrik akımı kullanan bir teknik. Hücrenin içinde, CRISPR birleştirici ve Cas9 vektörünün birlikte ekspresyonu, sırasıyla gRNA dizilerini ve Cas9 nükleazlarını oluşturur.

Her gRNA dizisi, karşılık gelen Cas9 enzimine bağlanarak, konakçı genomundaki hedef bölgelere bağlanan çoklu Cas9-gRNA kompleksleri oluşturur. Bu bağlanma, her iki DNA zincirinde de protospacer bitişik motifine veya PAM bölgesine yukarı akışta bir çentik üreten Cas9 enzimini aktive eder. Bu, hedef DNA'da çift iplikli bir kırılma veya DSB ile sonuçlanır.

Hedef gene herhangi bir homolog dizinin yokluğunda, hücrenin homolog olmayan uç birleştirme adı verilen endojen onarım mekanizması tetiklenir ve onarım proteinlerinin ve kinaz moleküllerinin kırılma bölgesinde bağlanmasına izin verir. Daha sonra, ligaz enzimi DSB'yi onarır ve hedef gen dizisinin modifikasyonlarına neden olur. Bu modifikasyonlar, genlerin işlevini bozar ve birden fazla genin nakavt olmasına neden olur.