siRNA Ters Transfeksiyon Tabanlı Gen Susturma In Vitro: Hedef Gen Ekspresyonunu İnaktive Etmek için Kültürlenmiş Hücrelerde Küçük Enterferans Yapan RNA Verme Prosedürü

siRNA'yı karıştırmak için geliştirilmiş minimum esansiyel ortamla pipetleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Transfeksiyon reaktifini ve geliştirilmiş minimal esansiyel ortamı siRNA'ya ekleyin ve karıştırmak için pipetleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Ardından, transfeksiyon karışımını kollajen kaplı plakanın her bir oyuğuna ekleyin.

100 milimetrelik Petri kabındaki hücreleri DPBS ile iki kez yıkayın. Hücrelere 5X tripsin ekleyin ve tüm yüzeyi tripsin ile kapladığınızdan emin olun. 30 saniye bekleyin ve tripsini dikkatlice çıkarın. Petri kabını inkübatörde 37 °C'de 5 ila 10 dakika inkübe edin.

Ardından, hücre hasarını önlemek için hücreleri ayırmak için tabağa hafifçe vurun. Tripsini nötralize etmek için piruvat, 25 mM glikoz, %10 FCS ve %1 penisilin ve streptomisin içermeyen 10 mililitre DMEM ekleyin. Hücreleri ayırmak ve hücre süspansiyonunu homojenize etmek için ortamı dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyin.

Bir Malassez sayma odası veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve hücrelerin konsantrasyonunu 6.25 x 10⁵ hücre / mL ortama ayarlayın. 12 oyuklu bir plakanın oyuklu başına 800 mikrolitre hücre süspansiyonu veya transfeksiyon karışımını içeren 24 oyuklu bir plakanın oyuklu başına 400 mikrolitre hücre süspansiyonu tohumlayın.

Plakaları bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin ve 24 saat boyunca rahatsız etmeyin. Ertesi gün, süpernatanı piruvat, 25 mM glikoz,% 10 FCS ve% 1 penisilin ve streptomisin içermeyen taze DMEM ile dikkatlice değiştirin ve hücreleri inkübatöre geri koyun.