Hedef Genlerde Indel Mutasyonu Tespiti için Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Dijital damlacık PCR, DNA'daki nükleotidlerin rastgele eklenmesi veya silinmesi olan indel mutasyonlarını tespit eder. Bu, numunenin küçük damlacıklara bölünmesi ve her damlacıktaki DNA'nın bağımsız olarak amplifiye edilmesiyle elde edilir.

ddPCR gerçekleştirmek için, hedef genin vahşi tip ve mutant varyasyonlarını içeren bir DNA örneği alın. Numune karışımını ve yağı, mikroakışkan kanalı içeren damlacık jeneratör odasının farklı bölmelerine yükleyin.

Numune ve yağ dar kanallardan hızla akar, bağlantı noktasında emülsifiye olur ve her biri birkaç DNA molekülü içeren birkaç damlacığa bölünür.

Şimdi, ileri ve geri primerler, dNTP'ler, termostabil DNA polimeraz ve farklı floroforlar ve söndürücü molekülleri ile etiketlenmiş iki prob içeren tamponlu bir PCR plakası alın. Her sonda, belirli bir alel türüne özgüdür - vahşi tip veya mutant olan.

Damlacıkları PCR plakasına aktarın. Plakayı bir termocycler'a yerleştirin ve reaksiyonu çalıştırın. Denatürasyon sırasında DNA zincirleri ayrılır. Tavlama sıcaklığında, primerler ve problar şablon DNA'ya tavlanır.

Yeşil ve turuncu floroforlu prob, sırasıyla vahşi tip ve mutant DNA dizisine bağlanır. Daha sonra, DNA polimeraz, florofor ve söndürücü moleküllerini probdan ayırarak primerleri uzatır ve bir floresan sinyali üretir.

Güçlendirilmiş ürünü analiz edin. Yeşil floresan gösteren damlacıklar, vahşi tip DNA dizisini içerirken, turuncu floresan indel mutasyonunu gösterir.