Çift genetik belirteçlerin eş zamanlı olarak ölçülmesi için dubleks dijital PCR

Dubleks dijital polimeraz zincir reaksiyonu — ddPCR — iki farklı genetik belirteçin aynı anda kantitatif olarak saptanmasına izin verir.

Başlamak için, iki farklı hedef dizisi içeren bir örnek alın. Termostabil bir DNA polimeraz enzimi, dNTP'ler ve hedefe özgü primerler içeren bir karışım ekleyin. Ardından, güçlendirilmiş hedefleri tespit etmek için floresan raportörler ve bir söndürücü molekül ile etiketlenmiş iki farklı hedefe özgü oligonükleotid probu ekleyin.

Çözelti, hedef dizileri çok sayıda nanodamlacığa bölmek için yağ ile emülsifiye edilir. Hedefi içeren her damlacık, ayrı bir reaksiyon kabı görevi görür.

Tek tek nanodamlacıkların içindeki amplifikasyon reaksiyonu için termal döngü sürecini başlatın.

Yüksek bir denatürasyon sıcaklığında, çift sarmallı hedefler tek sarmallara ayrılır.

Uygun tavlama sıcaklığına ulaşmak için sıcaklığı düşürün, astarların ve oligonükleotid problarının şablona bağlanmasına izin verin.

Söndürücünün yakınlığı, muhabirin floresansını bastırır. Uzatma sıcaklığında, DNA polimeraz primerleri uzatır ve oligonükleotid probunu parçalar. İlişkisiz muhabir floresan yayar.

Damlacıkları bir floresan algılama sistemi olan bir damlacık okuyucusundan geçirin. Tek veya çift floresansın algılanması, hedefleri içeren pozitif damlacıkları gösterirken, bir sinyalin olmaması negatif damlacıkları gösterir.

Pozitif damlacıkların toplam bölüm sayısına oranı, hedef dizilerin başlangıç konsantrasyonunu belirler.