Viral enfeksiyonları teşhis etmek için gerçek zamanlı kantitatif ters transkripsiyon PCR

Gerçek zamanlı kantitatif ters transkripsiyon PCR, viral enfeksiyonları tanımlamak için yararlıdır.

Hedef viral RNA'yı içeren bir örnekle başlayın. Ters transkriptaz enzimi ve dNTP'lerle birlikte hem DNA sentezine hem de amplifikasyona yardımcı olan hedefe özgü primerler ekleyin.

PCR döngüleri boyunca DNA'yı amplifiye etmek için bir enzim olan termostabil DNA polimeraz ve çift sarmallı DNA, dsDNA'ya giren bir boya olan SYBR yeşili ekleyin. Reaksiyonu bir termal döngüleyiciye yerleştirin. Primerlerin hedef RNA'ya bağlanması için uygun bir sıcaklık ayarlayın.

Ters transkriptaz, primere dNTP'ler eklerken, aynı anda şablon RNA'yı parçalayarak cDNA'yı sentezler.

Ters transkriptazı etkisiz hale getirerek sıcaklığı arttırın. Sıcaklığı düşürün, primerlerin sonraki amplifikasyon için cDNA'ya tavlanmasına izin verin. DNA polimerazın primerleri uzattığı ve dsDNA'yı sentezlediği uzatma adımına ulaşmak için sıcaklığı artırın.

Ardışık döngüler üstel dsDNA amplifikasyonu ile sonuçlanır. SYBR yeşili, DNA'ya artan sayılarda bağlanarak floresan emisyonunda orantılı bir artışa neden olur. Döngüler boyunca algılanan floresan sinyalini çizin.

Pozitif bir amplifikasyon eğrisi, numunede viral RNA'nın varlığını gösterir.

Erime sıcaklığına ulaşmak için sıcaklığı kademeli olarak artırın ve dsDNA'yı tek iplikçikler halinde denatüre edin. Bağlı boya molekülleri serbest bırakılır - floresanlarını kaybeder. Sıcaklığa karşı azalan floresansı çizin.

Virüse özgü erime sıcaklığına karşılık gelen bir zirve, viral enfeksiyonu doğrular.