Düşük frekanslı somatik mutasyonları tespit etmek için vahşi tip bloke edici PCR

Vahşi tip bloke edici polimeraz zincir reaksiyonu veya WTB-PCR, DNA örneklerinde yüksek bolluklu vahşi tip alellerin amplifikasyonunu inhibe ederken, düşük bolluklu mutant alelleri seçici olarak amplifiye ederek nokta mutasyonlarını tespit eder.

WTB-PCR, kilitli nükleik asitler veya LNA içeren tek sarmallı, modifiye oligonükleotid, numunenin tamamlayıcı olarak tamamlayıcı olarak tamamlayıcı olarak bağlanan vahşi tip DNA zincirine tamamlayıcı olarak kullanılır. LNA bağlanması, DNA polimerazın aktivitesini bloke eder ve vahşi tip şablon DNA'nın uzamasını engeller.

WTB-PCR gerçekleştirmek için, nükleaz içermeyen damıtılmış suda dNTP'ler, LNA'lar ve hedefe özgü ileri ve geri primerler içeren bir ana karışım alın.

Tüpe termostabil bir DNA polimeraz içeren çözelti ekleyin ve karışımı bir PCR plakasının kuyucuğuna pipetleyin. Yabani tip ve mutant DNA içeren genomik DNA örneğini kuyuya ekleyin ve PCR'ye başlayın.

PCR sırasında, yüksek sıcaklık aracılı denatürasyon, çift sarmallı DNA'ları ayırır. Ayrılan iplikler, primerlerin tavlanması için şablon görevi görürken, LNA, tamamlayıcı vahşi tip DNA zincirine bağlanır ve engelleyici-vahşi tip DNA hibritini oluşturur. Daha yüksek bir sıcaklıkta, DNA polimeraz dNTP'ler ekler ve primer-DNA şablonlarını genişletir.

LNA-DNA hibritinin DNA-DNA kompleksinden daha yüksek bir erime sıcaklığı, onu sağlam tutar. LNA'nın modifikasyonu sonunda DNA polimerazın LNA-DNA hibritini uzatmasını bloke eder ve bu da uzamasını engeller.

Birkaç PCR döngüsü boyunca, LNA aracılı blokaj, numunedeki vahşi tip varyantına göre mutant tip amplikonların sayısını arttırır ve seçici tespitlerine yardımcı olur.