Bakteriyofajları Numaralandırmak için Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu, qPCR yoluyla bakteriyofajları numaralandırmak için, optimize edilmiş bir tamponda Taq DNA polimeraz, primerler, deoksinükleotid trifosfatlar - dNTP'ler - ve floresan raportör boya molekülleri içeren bir qPCR reaksiyon kokteyli elde edin. Bir qPCR plakasının kuyularına aktarın.

Isıl işlem görmüş bakteriyofajları ekleyin. Isıl işlem, bakteriyofaj parçacıklarından bakteriyofaj DNA'sını serbest bırakır. Karışımın buharlaşmasını önleyerek plakayı kapatın. Uygun döngü koşullarını ayarlayarak plakayı qPCR sistemine yükleyin.

Yüksek sıcaklıklara ısıtma, çift sarmallı DNA'yı tek sarmallara denatüre eder. Aynı zamanda Taq DNA polimerazı aktive eder. Tavlama, diziye özgü primerlerin tamamlayıcı bakteriyofaj DNA zincirlerine bağlanmasına neden olur. Uzatma, aktive edilmiş Taq DNA polimerazın, primerin 3' ucuna dNTP'ler eklemesine izin vererek, büyüyen DNA zincirini 5' ila 3' yönünde uzatır.

Boya molekülleri, yeni sentezlenen çift sarmallı DNA'ya enterkalik yaparak floresan yoğunluğunun artmasına neden olur. Her PCR döngüsü, floresan yoğunluğunu artırarak hedef DNA miktarını iki katına çıkarır.

Ölçülen floresansın arka plan seviyesini aştığı eşik döngüsünü, Ct değerini belirleyin.

Ct değeri, başlangıç DNA miktarı ile ters orantılıdır, her bakteriyofaj genomu bir bakteriyofaj partikülüne eşdeğerdir ve bakteriyofaj DNA standart eğrisinden bakteriyofaj miktar tayinini kolaylaştırır.

Amplifikasyon sonrası, reaksiyon sıcaklığını kademeli olarak artırarak erime eğrisi analizi yapın. Belirli bir erime sıcaklığında, DNA'nın yarısı tek ipliklere ayrılarak boya moleküllerini serbest bırakır ve ani floresan azalmasına neden olur.

qPCR ürünü için benzersiz olan farklı bir erime sıcaklığı, ürün özgüllüğünü doğrular.