Belirli bir viral genomik diziyi tespit etmek için iç içe PCR

İç içe polimeraz zincir reaksiyonu, iç içe PCR, spesifik gen dizilerini seçici olarak çoğaltabilir.

Bir hedef viral diziyi tespit etmek için, uygun bir tamponda hedeflenen viral diziyi, dNTP'leri ve termostabil DNA polimerazı içeren daha büyük bir DNA bölgesini tamamlayan dış primerler içeren bir ana karışımla başlayın.

Virüsle enfekte olmuş hücrelerden ekstrakte edilen çift sarmallı viral DNA'yı bu karışıma ekleyin. Tüpü bir termocycler'a aktarın; ilk PCR döngüsünü çalıştırın.

Denatürasyon sırasında, çift sarmallı DNA iki tek sarmallı şablon üretir. Uygun bir tavlama sıcaklığında, dış astarlar karşılık gelen hedef dizilerine bağlanır. Daha sonra, DNA polimeraz, dNTP'leri kullanarak primerleri uzatır ve amplifiye edilmiş DNA içindeki spesifik diziyi içeren büyük amplikonlar üretir.

Bu amplikonları yeni bir tüpe aktarın. Daha büyük amplifiye DNA içinde daha küçük, daha spesifik bir diziyi hedefleyen iç veya iç içe primerler içeren taze bir ana karışım ile takviye edin. İkinci PCR'yi çalıştırın.

İkinci PCR sırasında, DNA zinciri denatüre olur. Denatürasyondan sonra, iç içe geçmiş primerler, tek sarmallı şablon üzerindeki hedef bölgeleri bağlar, ardından polimeraz aracılı primer uzantısı gelir.

Hedeflenen viral diziyi özel olarak çoğaltmak için ikinci PCR döngüsünü birkaç kez tekrarlayın.

Spesifik viral dizinin varlığını doğrulayarak daha küçük amplikonları görselleştirmek için PCR ürününü analiz edin.