Tek nükleotid varyantlarının miktar tayini için tüp içinde çip tabanlı dijital PCR

Dijital polimeraz zincir reaksiyonu - veya dPCR - tek nükleotid varyantlarının - veya SNV'lerin - genomda belirli bir pozisyonda tek bir nükleotidin ikame edilmesinin iki nükleotid varyasyonu veya alel oluşturduğu bir mutasyonun miktarını belirlemek için yararlıdır.

Tüp içinde çip dPCR tekniğini kullanarak nicelemeye başlamak için, SNV'leri (mutant alel ve karşılık gelen vahşi tip alel) içeren bir DNA örneği alın. Termostabil bir DNA polimeraz enzimi, dNTP'ler ve primerler içeren bir karışım ekleyin.

Daha sonra, aleller arasında ayrım yapmak için farklı renkli floresan raportörleri ile etiketlenmiş alele özgü oligonükleotid probları ve bir söndürücü molekül ekleyin. Söndürücünün muhabire yakınlığı floresansını bastırır.

Çözeltiyi bir mikroakışkan çipin reaksiyon odalarına bölün. Bir alel içeren her oda, bağımsız bir reaksiyon kabı görevi görür.

Çipli tüpü bir termal döngüleyicinin içine yerleştirin ve reaksiyonu başlatın. Yüksek bir sıcaklıkta, çift sarmallı DNA, tek sarmallara denatüre olur. Primerleri ve oligonükleotid problarını tamamlayıcı bölgelerine tavlamak için sıcaklığı düşürün.

Uygun bir uzatma sıcaklığında, DNA polimeraz primerleri uzatır ve probu parçalar. Söndürücüden uzaklık, muhabirin floresan emisyonunu sağlar.

Farklı renkli floresan sinyallerini okuyun ve alelleri içeren odaları tespit etmek için bir konum grafiği oluşturun.

Mutant alelin frekansını belirlemek için - varyant alel fraksiyonu - mutantı içeren odacıkların vahşi tip alele karşı oranını hesaplayın.