Nanoakışkan bir çip kullanarak nadir transkript varyantlarını tespit etmek için çip tabanlı dijital PCR

Çip tabanlı dijital PCR tekniği, tek bir reaksiyonu nanoakışkan bir çipin odalarına böler. Bölümlenmiş dizilerin amplifikasyonu, nadir transkript varyantlarının - düşük bir frekansta meydana gelen kanonik olmayan transkriptlerin - tespit edilmesini sağlar.

Başlamak için, hedef nadir transkript varyantının ve ortak varyantın cDNA'sını içeren bir örnek alın. Termostabil DNA polimeraz, dNTP'ler ve primerler içeren bir çözelti ekleyin.

Farklı floresan raportörler ve söndürücü molekülleri ile etiketlenmiş yaygın ve nadir transkript varyantına özgü oligonükleotid probları ekleyin. Söndürücü, yakın mesafedeyken muhabirin floresansını emer.

Karışımı nanoakışkan çip üzerine yükleyin. Çözelti, eşit büyüklükte nano odalara bölünür. Bir cDNA içeren her oda, bağımsız bir reaksiyon kabı görevi görür.

Termal döngü işlemini başlatın. Yüksek bir denatüre etme sıcaklığı, çift sarmallı DNA'yı tek sarmallara ayırır. Sıcaklığı düşürün, primerlerin ve oligonükleotid problarının tek DNA zincirleri üzerindeki tamamlayıcı bölgelere tavlanmasına izin verin.

DNA polimerazın astarı uzattığı ve probu parçaladığı uzatma adımına ulaşmak için sıcaklığı artırın. Söndürücüden uzaklık, muhabirin floresan emisyonunu sağlar. Floresan sinyalini okuyun.

Güçlendirilmiş nadir transkript hedefine sahip odaları ve hedeften yoksun odaları gösteren bir dağılım grafiği oluşturun. Hedef için pozitif sinyaller, numunede nadir transkript varyantının varlığını gösterir.