Viral Genomu Ölçmek için Nokta Blot Testi

Nokta leke tahlilini kullanarak viral DNA'yı ölçmek için, izole edilmiş bir viral DNA süspansiyonu ile başlayın. Çift sarmallı DNA'yı sonraki hibridizasyon için tek sarmallara denatüre etmek için alkali bir çözelti ile muamele edin.

Nokta leke aparatını önceden ıslatılmış bir naylon membran ile monte edin. Denatüre viral DNA ve doğrusallaştırılmış standart plazmid DNA çözeltilerini kuyucuklara yükleyin. Etkili negatif yüklü viral tek sarmallı DNA transferini kolaylaştıran ve elektrostatik etkileşimler yoluyla pozitif yüklü membran yüzeyine bağlanarak nokta desenleri oluşturan uygun bir vakum uygulayın.

Çalıştırmanın ardından, zarı sodyum sitrat tamponu ile yıkayın ve tahlil hassasiyetini artırmaya yardımcı olun. Kurutma sonrası, zarı ultraviyole ışığa maruz bırakın ve lekelenmiş DNA'yı zara çapraz bağlayın.

Membrana hibridizasyon tamponunda ısıyla denatüre edilmiş, heterolog olmayan bir DNA fragmanı ve viral genoma özgü radyoaktif fosfor etiketli DNA prob süspansiyonu ekleyin. İnkübe edin, hibridizasyonun kolaylaştırılması.

DNA fragmanları, kalan zar bölgelerine bağlanarak bloke edici ajanlar olarak işlev görür ve spesifik olmayan prob bağlanmasını en aza indirir. Radyoaktif prob, viral tek sarmallı DNA üzerindeki tamamlayıcı dizi ile melezleşir.

Hibritlenmemiş probları çıkarmak için yıkama tamponu ile yıkayın. Fosfor görüntü tarama sistemini kullanarak, nokta leke sinyalleri elde etmek için zar üzerindeki viral genoma hibritleştirilmiş radyoaktif problar tarafından yayılan radyoaktif sinyalleri ölçün

Standart eğriden, zar üzerindeki her bir noktanın sinyal yoğunluğu, numunedeki viral DNA miktarını hesaplamak için kullanılabilir.