DNA metilasyonunun derecesini belirlemek için 5-metilsitozin nokta lekesi

DNA metilasyonu, 5-metilsitozin oluşturmak için DNA'nın sitozin bazına bir metil grubunun eklenmesini içeren epigenetik bir modifikasyondur. Bu modifikasyon gen ekspresyonunu değiştirir.

Nokta lekesi yoluyla DNA metilasyonunu ölçmek için, farklı metillenmiş sitozin seviyeleri sergileyen çeşitli farklılaşma aşamalarında insan kondrositlerinden türetilen genomik DNA örneklerini alın.

DNA örneklerini güçlü bir alkali olan sodyum hidroksit ile işlemden geçirin ve ısıtın. Bu işlem, iki DNA zinciri arasındaki hidrojen bağlarını kopararak DNA denatürasyonuna neden olur. Alkaliyi nötralize etmek için amonyum asetat ekleyin ve aşırı DNA bozulmasını önleyin.

Naylon bir zar alın ve denatüre DNA örneklerini noktalar halinde tespit edin. Negatif yüklü DNA, elektrostatik etkileşimler yoluyla pozitif yüklü naylon zara bağlanır ve katı destek üzerinde lekelenmesine neden olur.

Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için lekeli membrana bir bloke edici tampon uygulayın. Daha sonra, zara anti-5-metilsitozin antikorları ekleyin ve inkübe edin. Bu antikorlar sadece DNA üzerindeki metillenmiş sitozine bağlanır.

Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın ve birincil antikorlara spesifik olarak bağlanan kemilüminesan enzim konjuge ikincil antikorları ekleyin.

Membran üzerine kemilüminesan bir substrat ekleyin. Antikor üzerindeki enzim, kemilüminesans üretmek için substrat ile reaksiyona girer - çeşitli yoğunluklarda noktalar verir.

Membranı görüntüleyin ve her numunedeki DNA metilasyonunun derecesine karşılık gelen noktaların yoğunluklarını ölçün.