Bir doku lizatındaki hedef proteinleri tahmin etmek için kantitatif nokta lekesi

Kantitatif nokta lekesi - veya QDB - bir numunedeki hedef proteinlerin konsantrasyonunu ölçmek için yararlı bir tekniktir. Numune bir polimerik zar üzerinde hareketsiz hale getirildikten sonra, proteinler immünoblotlama yoluyla tespit edilebilir.

Başlamak için, her bir kuyucuğun dibine bağlı bir nitroselüloz membrana sahip çok kuyulu bir plaka olan bir QDB plakası alın. Numuneyi - hedef proteini içeren bir doku lizatı - kuyu içindeki zarın ortasına ekleyin.

Numunenin kurumasını bekleyin. Hedef protein, kovalent olmayan etkileşimler yoluyla zara bağlanır.

Bir engelleme çözümü ekleyin. Çözeltideki proteinler, zar üzerindeki bağlanmamış bölgelere yapışır ve tespit reaktiflerinin spesifik olmayan bağlanmasını önler.

Daha sonra, numunedeki hedef proteine bağlanan birincil antikorları içeren bir çözelti ekleyin. Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın.

Ardından, ikincil bir antikor çözeltisi ekleyin. Bir peroksidaz enzimi ile etiketlenmiş bu moleküller, proteine bağlı birincil antikorlara bağlanır. Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın.

Son olarak, kemilüminesan bir substrat ve hidrojen peroksit içeren bir çözelti ekleyin. Hidrojen peroksit kullanarak, antikora bağlı peroksidaz, substratı oksitler ve ışık yayar. Bir plaka okuyucu kullanarak, numunenin lüminesans yoğunluğunu ölçün.

Hedef proteinin bilinen konsantrasyonları ile seri bir seyreltme kullanarak standart bir lüminesans eğrisi oluşturun. Hedef protein konsantrasyonunu belirlemek için numunenin ölçülen lüminesans değerini eğri üzerinde çizin.