Protein Ekspresyon Seviyelerini Tahmin Etmek için Kantitatif Western Blotting

Kantitatif western blotlama - toplam protein normalizasyonuna dayalı bir teknik - hedef protein ekspresyon seviyelerini ölçmek için yararlıdır.

Başlamak için, doku lizatını bir poliakrilamid gradyan jelin kuyucuklarına yükleyin. Lizat, diğer hücresel proteinlerle birlikte hedef proteini içerir.

Jeli, örnek proteinlerin gradyan boyunca elektroforetik olarak ayrılması için uygun bir voltajda çalıştırın. Tamamlandıktan sonra, jeli bir transfer yığınının polimerik zarının üzerine yerleştirin.

Ayrılan proteinleri zar üzerine aktarmak için bir elektrik akımı uygulayın. Ardından, zarı floresan toplam protein boyasına yerleştirin. Boyadaki yüklü boya molekülleri, zar üzerindeki tüm proteinlere elektrostatik olarak bağlanır.

Bir engelleme çözümü ekleyin. Çözeltideki proteinler böylece zara bağlanır. algılama reaktiflerinin spesifik olmayan bağlanmasını önlemek. Sadece hedef proteine bağlanan bir birincil antikor ekleyin. Ardından, birincil antikora bağlanan bir florofor ile etiketlenmiş ikincil bir antikor ekleyin.

Numuneyi bir lazerle uyarın. Toplam protein boyasının boya moleküllerinden ve antikora bağlı floroforlardan yayılan floresansı karşılık gelen dalga boylarında kaydedin.

Normalleştirilmiş protein yükleme değerini hesaplamak için, her şeridin toplam protein sinyalini en yüksek değere bölün. Hedef proteinin nispi ekspresyonunu belirlemek için hedef protein sinyalini karşılık gelen normalleştirilmiş yükleme değerine bölün.