Hücre heterojenliğini belirlemek için tek hücreli western blotlama

Enflamasyon bölgeleri, monositler, makrofajlar ve lökositler dahil olmak üzere çeşitli bağışıklık hücreleri içerir.

Tek hücreli batı lekeleme ile heterojen bir hücre popülasyonunu tanımlamak için, bloklar halinde desenlenmiş fotoaktive edilebilir bir poliakrilamid jelden oluşan, önceden hidratlanmış bir kurutma çipi alın. Her blokta çok sayıda mikro kuyu vardır. Birkaç bloğa desenleme, birden çok hücreyi paralel olarak yakalar.

Heterojen bir hücre popülasyonu içeren bir süspansiyon ekleyin. Kuyunun boyutları, tek hücrelerin yerleşmesine izin verir. Çipi uygun bir tamponla doldurulmuş bir elektroforez odasına daldırın. Tampondaki deterjan molekülleri hücre zarını bozarak hücresel içeriği serbest bırakır.

Bir elektrik alanı uygulayın. Serbest bırakılan proteinler jel boyunca göç eder ve farklı büyüklükte bantlara ayrılır. Spesifik olarak bağlı olmayan molekülleri çıkarmak için çipi bir yıkama tamponu ile yıkayın ve istenen işaretleyici proteinler de dahil olmak üzere yalnızca hücresel proteinleri bırakın.

Jeli UV ışığına maruz bırakın, yüzeyini aktive edin ve proteinleri hareketsiz hale getirin.

Her hücre tipine özgü işaretleyici proteinlere spesifik olarak bağlanan ve protein-birincil antikor kompleksleri oluşturan bir birincil antikor kokteyli ekleyin. İlgili birincil antikorlarını bağlayan ve karşılık gelen hücreye özgü işaretleyici proteini etiketleyen floresan etiketli ikincil antikorların bir karışımını dağıtın.

Çipi bir tarayıcıya yerleştirin. Numune hücresi süspansiyonunun tek bir hücresine özgü karşılık gelen protein markörünün ekspresyon seviyesi ile orantılı olan floresan yoğunluğunu ölçün.