Chemiluminescent Western Blot Assay for Protein Processing

CD95 - bir ölüm reseptörü - agonistik antikorlarına bağlanır ve ölümü indükleyen bir sinyal kompleksinin veya DISC'in - prokaspaz 8'i işe alan bir multiprotein kompleksinin montajını tetikler. DISC'te, prokaspaz 8 bölünür ve çeşitli ara bölünme ürünleri ve son olarak apoptozu başlatan aktif bir form oluşturmak için işlenir.

Kemilüminesan western blotlama kullanarak kaspaz-sekiz işlemeyi analiz etmek için, bir tüpte kaspaz 8'in DISC ile ilişkili ara bölünme ürünlerini içeren bir lizat alın. Bunu protein A-agaroz boncuk yakalanmış anti-CD95 antikorları ile destekleyin. Anti-CD95 antikorları, DISC bileşeni olan CD95'e bağlanarak protein kompleksleri oluşturur.

Farklı boyutta immünopresipite edilmiş kaspaz 8 ara ürünlerini farklı bantlar olarak ayırmak için numuneyi bir SDS-poliakrilamid jel üzerine yükleyin. Jeli bir kurutma zarına yerleştirin ve bir elektrik akımı uygulayın. Kaspaz 8 ara ürünleri jelden lekelenme zarına doğru hareket eder.

Protein bağlanma bölgelerini doyurmak için zarı bloke edici protein içeren bir çözelti ile muamele edin - spesifik olmayan bağlanmaları önleyin.

Belirli bir bölgedeki kaspaz-sekiz ürünlerine bağlanan bir birincil antikor çözeltisi ekleyin.

Bir kaspaz-sekiz bölünme ürünü-birincil antikor-ikincil antikor kompleksi oluşturmak için birincil antikorun tamamlayıcı Fc bölgesine spesifik olarak bağlanan enzim etiketli ikincil antikorlar ekleyin.

İkincil antikor konjuge enzim ile reaksiyona giren ve ışık yayan bir kemilüminesan substrat ekleyin. Yayılan ışığın yoğunluğu, kaspaz-sekiz bölünme ürün miktarı ile ilişkilidir.