Fare Embriyonik Kök Hücre Genomunda Homolog Rekombinasyonu Tespit Etmek için Güney Blotting

Southern blotlama, prob tabanlı algılama yoluyla karmaşık bir DNA karışımından spesifik DNA dizilerinin tanımlanmasını içerir.

Southern blot ile fare embriyonik kök hücrelerinde homolog rekombinasyon veya HR olaylarını tanımlamak için hücrelerden genomik DNA elde edin. DNA'yı daha küçük parçalara sindirmek için bir kısıtlama enzimi ile inkübe edin.

DNA'yı bir agaroz jel üzerine yükleyin. Boyuta dayalı parça ayrımı için elektroforez gerçekleştirin.

Pürin bazlarını çıkarmak için jele asidik bir çözelti uygulayın ve çift sarmallı DNA'yı, dsDNA'yı gevşetin. Alkali denatüre edici çözelti ekleyin. Yüksek pH, hidrojen bağlarını bozar ve gevşemiş dsDNA'yı tek sarmallı DNA'ya, ssDNA'ya denatüre eder. Jel pH'ını nötralize etmek için nötralize edici bir çözelti ile inkübe edin.

Kurutma kağıtları, naylon bir zar ve zarın üzerine yığılmış jel kullanarak transfer sistemini monte edin. Aktarımı gerçekleştirin. ssDNA, aşağı doğru kılcal hareket yoluyla jelden zara geçer.

Membranı ultraviyole ışınlarıyla ışınlayın, DNA'yı çapraz bağlayın ve hareketsiz hale getirin. Membranı bir hibridizasyon çözeltisi içeren bir tüpe yerleştirin. Rotasyon ile inkübe edin, zarı kaplayın ve spesifik olmayan prob bağlanmasını önleyin.

Son olarak, zarı tek sarmallı radyoaktif etiketli problar içeren hibridizasyon tamponu ile inkübe edin. Problar, dizi tamamlayıcılığı yoluyla spesifik DNA bölgelerine bağlanır.

Bağlanmamış probları çıkararak zarı yıkayın. Membranı X ışınlarına maruz bırakın. Zar üzerindeki farklı bantlar, HR olaylarını içeren DNA bölgelerini kontrol bölgelerinden ayırır.